[摘要]采用大鼠在體腸單向灌流實驗模型，利用HPLC-ELSD測定腸灌流液中蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖和巴戟甲素等5種低聚糖的含量，研究各低聚糖在小腸段(十二指腸、空腸、回腸)和結腸的吸收情況，并考察藥物濃度、灌流液pH以及P-糖蛋白(P-gp)抑制劑對藥物吸收的影響，得出各低聚糖成分在大鼠體內的腸吸收機制。結果顯示5種低聚糖均為全腸道吸收的藥物，吸收速率與灌流液pH、藥物濃度和腸段部位有關。鹽酸維拉帕米可顯著增加蔗糖與巴戟甲素的吸收量，提示蔗糖與巴戟甲素是P-gp的底物。5種低聚糖在大鼠腸道內的吸收機制以被動擴散方式為主，不存在飽和吸收，其在全腸段的吸收均較好，吸收部位主要在十二指腸和空腸。

　　[關鍵詞]臨床醫學論文,巴戟天低聚糖,腸吸收,單向灌流法,P-糖蛋白

　　Study on intestinal absorption features of oligosaccharides in

　　Morinda officinalis How.with sigle-pass perfusion

　　DENG Shao-dong1， ZHANG Peng2， LIN Li2*， XIAO Feng-xia2， LIN Jing-ran2

　　(1.The Second School of Clinical Medicine， Guangdong Medical College， Dongguan 523808， China;

　　2. College of Chinese Materia Medica， Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine， Guangzhou 510006， China)

　　[Abstract]To study the in situ intestinal absorption of five oligosaccharides contained in Morinda officinalis How. (sucrose， kestose， nystose， 1F-Fructofuranosyinystose and Bajijiasu). The absorption of the five oligosaccharides in small intestine (duodenum， jejunum and ileum) and colon of rats and their contents were investigated by using in situ single-pass perfusion model and HPLC-ELSD. The effects of drug concentration， pH in perfusate and P-glycoprotein inhibitor on the intestinal absorption were investigated to define the intestinal absorption mechanism of the five oligosaccharides in rats. According to the results， all of the five oligosaccharides were absorbed in the whole intestine， and their absorption rates were affected by the pH of the perfusion solution， drug concentration and intestinal segments. Verapamil Hydrochloride could significantly increase the absorptive amount of sucrose and Bajijiasu， suggesting sucrose and Bajijiasu are P-gp′s substrate. The five oligosaccharides are absorbed mainly through passive diffusion in the intestinal segments， without saturated absorption. They are absorbed well in all intestines and mainly in duodenum and jejunum.

　　[Key words]oligosaccharide extracted from Morinda officinalis; intestinal absorption; single-pass intestinal perfusion; P-glycoprotein

　　doi：10.4268/cjcmm20150126

　　巴戟天為茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How. 的肉質根，歸腎、肝經，具有補腎助陽之功效，自古被譽為“補腎陽之要藥”，已證實巴戟天糖類物質含量近50%，其中以低聚糖類成分為主[1]。近期藥效研究表明，巴戟天低聚糖(oligosaccharide extracted from Morinda officinalis，OMO)可顯著提高擬癡呆大鼠的學習記憶能力[2]、改善癡呆癥狀[3]，其中巴戟甲素、耐斯糖等低聚糖單體活性成分也顯示具有神經細胞保護作用[4]、抗抑郁[5]、抗骨質疏松[6]等多種生物活性，表明巴戟天低聚糖類成分具有顯著的開發利用前景。目前，以巴戟天為原料開發出的藥品均以口服劑型為主，如巴戟天寡糖膠囊、巴戟口服液等，然而關于巴戟天低聚糖的胃腸道吸收機制研究的報道較少。因此，本研究采用大鼠在體腸單向灌流模型考察該巴戟天低聚糖有效部位中蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖和巴戟甲素等5種低聚糖類成分的大鼠腸吸收特點，以揭示巴戟天低聚糖類成分的腸道吸收機制，確定各成分的最佳吸收部位，并考察了P-gp對巴戟天低聚糖類成分吸收的影響，以期為巴戟天低聚糖類藥物的劑型開發及其在臨床上的合理用藥提供科學依據。 　　1材料

　　1.1試藥

　　巴戟天低聚糖(OMO，自制，經鑒定純度>95%);蔗糖(廣東光華化學，批號20060717)，蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖(日本WAKO公司，批號分別為295-64111，292-64121，299-64131)，巴戟甲素(按專利201010224513.2方法自制)，純度均>98%;鹽酸維拉帕米(中國食品藥品檢定研究院，批號100223-200102);乙腈、甲醇(色譜純，德國Merk公司);空白灌流液( Krebs-Ringer′s營養液，自配，每升含NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，CaCl2 0.12 g，MgCl2 0.02 g，NaH2PO4 0.32 g，NaHCO3 1.37 g，用NaOH或H3PO4調節pH);氨基甲酸乙酯、三乙胺等試劑均為國產分析純;實驗用水均為自制超純水。

　　1.2儀器

　　美國WATERS 2695型液相系統配備WATERS 2424型蒸發光散射檢測器，BP211D型電子分析天平(德國Sartorius公司)，Genpure超純水系統(德國TKA公司)，HH-S6數顯恒溫水浴鍋(常州普天儀器公司)，BT100-1F數顯恒流泵(保定蘭格恒流泵有限公司)，PHB-3型pH計(上海三信儀表廠)，KQ-500型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，佳美SK-1快速混勻器(江蘇金壇市佳美儀器廠)，TGL-16aR型臺式冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)。

　　1.3動物

　　雄性SD大鼠，體重200～250 g，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號SCXK(粵)2008-0020，實驗前動物禁食12 h，自由飲水。

　　2方法與結果

　　2.1色譜條件

　　色譜柱采用Waters XBridgeTM Amide(4.6 mm×150 mm，3.5 μm)，柱溫40 ℃，以乙腈為流動相A，0.2%三乙胺溶液為流動相B，梯度洗脫0～25 min，75%～65%A;25～55 min，65%～60%A;55～56 min，60%～25%A;56～60 min，25%A;60～63 min，25%～75%A;63～70 min，75%A;流速0.6 mL・min-1;漂移管溫度90 ℃;噴霧器模式加熱，100%;氣壓40 Pa;增益20倍;進樣體積10 μL。

　　2.2對照品溶液的制備

　　精密稱取蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖、巴戟甲素對照品適量，加入空白灌流液制得每1 mL含蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖、巴戟甲素分別為2.03，3.01，4.30，5.90，10.0 mg的混合對照品儲備液，備用。

　　2.3樣品處理

　　取樣品液2 mL，置于4 ℃離心機中1萬 r・min-1，7 250×g離心10 min，取上清液過0.22 μm水系微孔濾膜，取續濾液10 μL 直接進樣。

　　2.4方法學考察

　　2.4.1專屬性實驗分別取空白灌流液、含OMO的灌流液、經灌流后含OMO的樣品液、含維拉帕米的灌流樣品液及混合對照品儲備液，按2.3項下處理，進樣分析，見圖1。

　　2.4.2標準曲線制備分別取2.2項下對照品儲備液0.25，0.50，1.0，2.0，2.5 mL置于5 mL容量瓶中，以空白灌流液定容至刻度，搖勻后，按2.3項下處理， 進樣10 μL。以各成分進樣質量X(ng)的對數值(lgX)為橫坐標，以其峰面積積分值Y的對數值(lgY)為縱坐標繪制標準曲線，求得回歸方程，見表1。

　　2.4.3精密度及回收率精密量取2.2項下對照品儲備液適量，以空白灌流液稀釋，分別配制得蔗糖(0.101 5，0.406 0，1.015 g ・L-1)、蔗果三糖(0.150 5，0.602 0，1.505 g ・L-1)、耐斯糖(0.215 0，0.860 0，2.150 g ・L-1)、1F-果呋喃糖基耐斯糖(0.295 0，1.180，2.950 g ・L-1)、巴戟甲素(0.500 0，2.000，5.000 g ・L-1)不同質量濃度的混合對照品溶液，按2.3項下處理，平行制備5份，于

　　同一天內測定5次和5 d內分別測定，計算方法回收率、日內和日間精密度(用RSD表示)，見表2。

　　2.4.4灌流液中低聚糖類成分的穩定性考察取大鼠禁食12 h后，用空白灌流液進行大鼠在體單向腸灌流，取0～120 min內腸灌流液。精密稱取適量OMO，以上述腸灌流液溶解后在37 ℃水浴中放置

　　12 h，分別于0，2，4，8，12 h取樣，按樣品處理方法進行處理后進樣分析，以各時間點的峰面積與0 h的峰面積比值作為剩余百分含量，考察其穩定性。計算得各組分平均剩余含量均大于95%，RSD均小于2.1%，結果表明，12 h內各待測物含量未發生明顯變化，此條件下各低聚糖類成分的穩定性良好，見表3。

　　2.4.5物理吸附的考察分別取腸段和灌流管置于含OMO 12.001 g・L-1的灌流液中37 ℃恒溫水浴孵育30 min，孵育前后的供試品溶液，按2.3項下操作，以后者對前者的各組分峰面積比值計算絕對回收率。各組分的絕對回收率均大于95%，表明大鼠腸壁和灌流管對OMO中5種低聚糖類成分基本無物理吸附，見表4。 　　2.5大鼠在體腸灌流試驗[7-8]

　　2.5.1方法取生理鹽水、OMO灌流液、供試液和收集液小瓶置37 ℃恒溫水浴，將禁食過夜的大鼠(自由飲水) ，腹腔注射20%烏拉坦溶液(200 mg・kg-1) 麻醉。背位固定，沿腹中線打開腹腔，選取實驗所需的各個腸段，取約10～15 cm于兩端切口，插管并結扎，用預熱至37 ℃的生理鹽水緩慢地將腸內容物沖洗干凈，然后用生理鹽水沖洗30 min，將傷口用浸有生理鹽水的脫脂棉覆蓋保濕，紅外燈下保溫。實驗時取一定濃度的OMO灌流液(預熱37 ℃) 100 mL，先以1.0 mL・min-1的流速灌流10 min，再將流

　　速調為約0.2 mL・min-1，開始計時，每隔15 min迅速更換1次已知質量的供試液小瓶和收集液小瓶，直至120 min，稱質量，計算灌入和收集的供試液質量。實驗結束后，剪下被考察腸段，測量其長度(L)和橫截面半徑(r)。

　　大鼠各個腸段的選擇：十二指腸段自幽門1 cm處開始向下取10 cm，空腸段距幽門15 cm處開始向下取10 cm，回腸段自盲腸上行20 cm處開始向下取10 cm，結腸段從盲腸后段開始向下取10 cm。

　　2.5.2灌流液體積的校正及數據處理小腸不僅吸收藥物，也吸收和分泌水分，導致灌流液體積變化，因此，不能用直接測定藥物濃度的方法計算藥物的吸收。本實驗采用重量法對灌流液流入和流出的體積進行校正，消除其體積變化的影響。具體步驟為精密量取供試液0.50 mL 放入已經稱重的干凈玻璃瓶中，稱量液體的質量，算出其密度ρin。從接收液樣品中精密量取0.50 mL，放入已經稱重的干凈玻璃瓶中，稱量液體的質量，計算出接收液的平均密度ρout。Vin=min/ρin;Vout= mout /ρout;式中min，mout分別為一定時間內進出腸道灌流液的質量。按下面的公式計算藥物吸收速率常數(Ka) 和藥物表觀滲透系數(Papp) ，式中Vin和Vout分別為灌入和收集的供試液體積(mL);Cin和Cout分別為進口和出口處緩沖液中的藥物質量濃度(g・L-1);L和r分別為被考察腸段長度(cm) 和半徑(cm);Qin為灌流速度(0.2 mL・min-1) ;t為灌流時間(h);由灌流前后剩余藥量差值求出每小時單位面積腸壁上的各組分的累積吸收量A(μg・cm-2・h-1);Ka，Papp，A為8個時間段(0～120 min)樣品的平均值。測定結果以±s表示，組間差異比較采用SPSS 19.0統計軟件進行單因素方差分析，P<0.05表示差異有顯著性。

　　Papp=-QinlnCoutCin×VoutVin2πrL(1)

　　Ka=1-CoutCin×VoutVin×Qinπr2L(2)

　　A=Cin×Vin-Cout×Vout2πrLt(3)

　　2.6灌流液pH對OMO在體腸吸收的影響

　　分別用pH 5.4，6.8，7.4的Kreb-Ringer′s灌流液(OMO質量濃度為12.1 g・L-1)對全腸段灌流，考察pH對OMO在全腸段吸收的影響。

　　經方差分析，蔗糖在pH 7.4，6.8，5.4灌流液中的Papp無顯著性差異;蔗果三糖、巴戟甲素在pH 7.4灌流液中的Papp與pH 6.8，5.4有顯著性差異(P<0.05);耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖在pH 5.4灌流液中的Papp與pH 7.4有顯著性差異(P<0.05)，pH 7.4與pH 6.8之間無顯著性差異。各低聚糖在pH 7.4灌流液中的Papp與Ka均較大，因此選擇pH 7.4的灌流液進行試驗，見表5。

　　2.7OMO濃度對腸吸收的影響

　　分別用OMO質量濃度為6.01，12.02，24.04 g・L-1的Kreb-Ringer′s灌流液(pH 7.4)對全腸段灌流，考察藥物濃度對其吸收的影響。

　　經方差分析，OMO中5種成分在各自的3個實驗濃度范圍內，在大鼠全腸段的吸收速率(Ka)均無顯著差異，其藥物累積吸收量隨灌流液藥物濃度的增加而近似線性地增加，說明藥物不存在自身濃度

　　表5OMO中5種成分在不同pH灌流液中的吸收參數(±s，n=6)

　　Table 5Effects of perfusate′s pH on the Ka and Papp of five oligosaccharides in rats(±s，n=6)

　　抑制現象，提示OMO中5種低聚糖成分的在體腸吸收機制均以被動擴散為主，其吸收動力學符合一級過程。

　　對各成分在全腸段的吸收進行比較，方差分析結果顯示，高濃度和中濃度下，巴戟甲素與其他各成分之間的Ka存在顯著性差異(P<0.05);在低濃度下，巴戟甲素與蔗糖的吸收不存在顯著性差異，與其他3個成分之間存在顯著性差異(P<0.05)。同時，巴戟甲素的吸收參數(Ka，Papp，A)均大于其他各成分。各成分的吸收速率依次為：巴戟甲素>蔗糖>蔗果三糖>耐斯糖>1F-果呋喃糖基耐斯糖，見表6。

　　2.8OMO在大鼠不同腸段中的吸收特點

　　取OMO質量濃度為12.02 g・L-1的灌流液分別在十二指腸、空腸、回腸和結腸 4個腸段進行灌流，考察OMO在大鼠各腸段的吸收情況。 　　分別對5種低聚糖成分在各腸段的吸收參數進行方差分析，結果顯示，蔗糖、蔗果三糖在十二指腸

　　吸與回腸、結腸的吸收有顯著性差異(P<0.05)，而十二指腸與空腸之間無顯著性差異，其中空腸的吸收速率較大，說明蔗糖、蔗果三糖的吸收部位主要在空腸，各腸段的吸收速率依次為空腸>十二指腸>回腸>結腸;耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖在十二指腸的吸收與回腸、結腸的吸收有顯著性差異(P<0.05)，而十二指腸與空腸之間無顯著性差異，其中十二指腸的吸收速率較大，說明耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的吸收部位主要在十二指腸，各腸段的吸收速率依次為十二指腸>空腸>回腸>結腸;巴戟甲素在十二指腸的吸收與空腸、回腸、結腸的吸收均有顯著性差異(P<0.05)，說明巴戟甲素的吸收部位主要在十二指腸，各腸段的吸收速率依次為十二指腸>空腸>回腸>結腸。

　　對不同腸段中各成分的吸收進行比較，方差分析結果顯示，在十二指腸腸段，巴戟甲素與其他各成分之間均具有明顯的統計學差異(P<0.05)，且巴戟甲素的吸收參數(Ka，Papp，A)均大于其他成分，提示十二指腸段巴戟甲素的吸收相對較快，吸收速率依次為巴戟甲素>蔗糖>蔗果三糖>耐斯糖>1F-果呋喃糖基耐斯糖;在空腸腸段，巴戟甲素與蔗糖、蔗果三糖之間無顯著性差異，巴戟甲素與耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖之間均有顯著性差異(P<0.05)，提示空腸段巴戟甲素與蔗糖、蔗果三糖的吸收情況相似，吸收速率依次為巴戟甲素>蔗果三糖>蔗糖>耐斯糖>1F-果呋喃糖基耐斯糖;在回腸腸段，巴戟甲素與蔗糖之間無顯著性差異，巴戟甲素與蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖之間均有顯著性差異(P<0.05)，提示回腸段巴戟甲素與蔗糖的吸收情況相似，吸收速率依次為蔗糖>巴戟甲素>蔗果三糖>1F-果呋喃糖基耐斯糖>耐斯糖;結腸段與回腸段比較結果一致，其吸收速率依次為蔗糖>巴戟甲素>蔗果三糖>1F-果呋喃糖基耐斯糖>耐斯糖，見表7。

　　2.9P-gp抑制劑對OMO腸吸收的影響

　　以鹽酸維拉帕米作為P-gp抑制劑，分別在pH 7.4的Kreb-Ringer′s灌流液(OMO質量濃度12.02 g・L-1)中加入鹽酸維拉帕米至0，0.6 mmol・L-1作為2組供試液。實驗前分別用2組供試液以2.0 mL・min-1的流速快速平衡孵育腸段和灌流管10 min，其他操作同2.5.1項。對十二指腸灌流，考察P-gp抑制劑對OMO吸收的影響。

　　對各成分的2組吸收參數進行統計分析，結果顯示，加入P-gp抑制劑對蔗糖與巴戟甲素的Ka，Papp均有顯著性影響(P<0.05)，而對其他成分無顯著性影響(P>0.05)。鹽酸維拉帕米可顯著增加蔗糖與巴戟甲素的吸收量，這種促吸收效果是通過抑制P-gp的外排引起的，由此提示蔗糖與巴戟甲素是P-gp的底物，見表8。

　　3討論

　　本實驗以OMO為研究對象，主要含有蔗糖(二糖)、巴戟甲素(二糖)、蔗果三糖(三糖)、耐斯糖(四糖)、1F-果呋喃糖基耐斯糖(五糖)等低聚糖成分，實驗結果中顯示在全腸段吸收中，其吸收速率依次為二糖>三糖>四糖>五糖，推測可能與各成分的分子大小有關。在本實驗條件中，各成分在不同腸段中的Papp均大于0.072 cm・h-1，說明各低聚糖成分在整個腸段中吸收良好[9]，屬于高滲透性藥

　　物，主要與各成分均具有較強的親水性從而易于在腸道中吸收擴散進入體內有關。

　　藥物進入體循環的速度和程度是決定藥物療效及安全性的重要因素，藥物只有在預期的時間內釋放并被有效部位吸收才能產生療效，故研究藥物的腸吸收特點將可以減少劑型設計的盲目性，為劑型的開發提供科學依據。從實驗結果中可看出，巴戟天低聚糖中的成分主要在小腸段(十二指腸、空腸)中吸收，因此，可設計相應的緩控釋制劑，準確控制藥物釋放的部位和速率，提高巴戟天低聚糖的口服生物利用度。

　　與離體腸吸收實驗相比，在體腸灌流法因不切斷血管和神經系統，提高了腸段的生物活性。在體腸灌流主要分為在體單向腸灌流和在體循環腸灌流，在體循環腸灌流因灌流時間長(4～6 h)和灌流速度較大(2～5 mL・min-1)對腸道的腸黏膜損傷較大，導致藥物的吸收增加，造成實驗結果與真實情況存在較大誤差[10-12]。灌流速度在一定程度上代表腸道蠕動的生理狀態，在健康志愿者體內腸灌流實驗中，灌流速度多選用2～3 mL・min-1，由于大鼠腸道的內徑約為人腸道的1/10，因而單向腸灌流以較低灌流速度(0.2～0.3 mL・min-1)對需要考察的腸段進行單向灌流，其吸收速率穩定，與人體腸吸收有良好的相關性[13]。

　　P-gp屬多藥耐藥蛋白，通過將藥物從細胞內主動轉運到細胞外，參與藥物的吸收和靶組織轉運，具有重要的生理學功能。當某一藥物或化學成分影響了P-gp的活性，則能改變另一種藥物或成分的吸收速率及吸收程度，并最終影響其血藥濃度。實驗結果表明，鹽酸維拉帕米可顯著增加蔗糖與巴戟甲素的吸收量，這種促吸收效果是通過抑制P-gp的外排引起的，由此提示蔗糖與巴戟甲素是P-gp的底物，其相關的作用機制有待進一步的研究。 　　[參考文獻]

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