固定化酶是酶工程的核心技術之一,有利于實驗酶的重復使用及產物與酶的分離,將酶工程提高到一個新的水平,極大地促進了酶工程的研究與應用,并廣泛應用于各個領域。綜述了固定化酶的制備方法,總結了其在食品工業中的應用,并對其的發展進行了展望。

　　《食品科學技術學報報》食品雜志，創刊于1983年，國內外公開發行。《食品科學技術學報報》宗旨是在立足原有的輕工行業特色的基礎上，以繁榮科學文化，促進學術交流，促進生產技術水平提高以及發現和培養人才為辦刊宗旨，是以輕工類科學技術研究為主要特色的學術理論性刊物。

　　固定化酶技術是20世紀60年展起來的一項生物工程技術。酶的固定化(immobilization of enzymes)是用固體材料將酶束縛或限制于一定區域內,進行特有的催化反應,并可回收及重復利用的技術[1]。固定化酶的研究不僅在化學生物學、生物工程醫學及生命科學等領域異常活躍,而且因為其節省能源與資源、減少污染的生態環境效應而符合可持續發展的戰略要求[2]。

　　1固定化酶的定義與特點

　　固定化酶技術是將酶用人工方法固定在特定載體上,進行催化、生產,因而固定化酶一般可以被認為是不溶性酶。與水溶性酶相比,其優點如下:易于將固定化酶與底物、產物分高,便于后續的分離和純化;可以在較長時間內連續生產;酶的穩定性和最適溫度提高;酶反應條件容易控制;可以增加產物的收率,提高產物質量;酶的使用效率高,使用成本低;適于產業化、連續化、自動化生產。與此同時,由于酶的分離、固定化處理等原因,固定化酶也具有一些難以避免的缺點:在固定化過程中,酶活力會損失;生產成本提高,工廠初期投資大;只能用于水溶性底物,適合于小分子;不適宜于多酶反應,還需要需要輔助因子的協助才可以有效反應[3-4]。

　　2固定化酶的方法

　　酶的固定方法主要有吸附法、包埋法、共價鍵合法和一些其他方法,針對不同的酶、不同的載體,需要采用不同的方法,有時還需要將幾種方法聯合使用。

　　2.1吸附法

　　吸附法是通過非特異性物理吸附法或生物物質的特異吸附作用將酶吸附在炭、有機聚合物、玻璃、無機鹽、金屬氧化物或硅膠等材料上。該方法又分為物理吸附法和離子吸附法。此法簡便,且酶變性的可能性較小。但是在酶和載體結合具有弱鍵的本質,在使用過程中易解吸,又由于載體具有非特異性吸附劑的本質,因此可能同時吸附除酶以外的其他物質[4]。

　　2.2包埋法

　　包埋法是指酶或細胞包埋在各種多種載體(如聚丙烯酰胺凝膠、矽酸鹽凝膠、藻酸鹽、角叉菜聚糖等)中發生聚合、沉淀或凝膠化使之固定的方法。主要分為凝膠包埋法和微膠囊包埋法,該方法操作簡單,酶活回收率較高,但發生化學反應時,酶易失活,適用于小分子底物和產物的酶。

　　2.3結合法

　　結合法指選擇適宜的載體,使之通過共價鍵或離子鍵與酶結合在一起的固定方法。包括離子鍵結合法和共價鍵結合法。離子鍵結合法操作簡單,條件溫和,酶活性損失少,但酶與載體結合力弱,酶易脫落,這也是最常用的方法之一。共價鍵結合法研究較為成熟,酶與載體結合牢固,一般不輕易脫落,但反應條件較劇烈,會引起酶蛋白空間構象的變化,破壞酶的活性部位。

　　2.4交聯法

　　交聯法是用雙功能試劑或多功能試劑進行酶分子之間的交聯,是酶分子和雙功能試劑或多功能試劑之間形成共價鍵,得到三向德交聯網狀結構,除了酶分子之間發生交聯外,還存在一定的分子內交聯。根據使用條件和添加材料的不同,還能夠產生不同物理性質的固定化酶。此法反應條件較劇烈,酶活回收率很低,故不常用。一般將吸附法和交聯法2種方法結合起來使用。

　　3固定化酶在食品工業上的應用

　　3.1固定化酶在柑橘汁加工中的應用

　　柑桔加工產品出現過度苦味是柑桔加工業中較重要的問題,苦味物質主要由2類物質組成:一類為檸檬苦素的二萜烯二內酯化合物(A和D環);另一類為果實中多種黃酮苷,其中柚皮苷為葡萄柚和苦橙等柑桔類果汁中的主要黃酮苷,柚皮苷的苦味與鼠李糖和葡萄糖連接鍵的分子構象有關[5]。主要是利用不同的酶分別作用于檸檬苦素和柚皮苷生成不含苦味的物質。Manjon等使用空心玻璃床作為載體,分別使DEAE-Sephadex和單寧-氨基乙基纖維(tanninamino ethy1 cellulose)作為載體;Puri等使用海藻糖;Soures等使用醋酸纖維和三醋酸纖維制成膜固定酶,其試驗結果都表明用固定化酶處理后的果汁苦味明顯降低。

　　3.2固定化果膠酶在果汁加工中澄清的應用

　　在果汁加工中,果膠的存在會使壓榨與澄清困難,而果膠酶是指分解果膠物質的多種酶的總稱。Lozano等[6]將尼龍膜進行O-烷基化活化后與果膠酶共價偶聯,然后置于微濾反應器中,被降解的小分子果膠隨濾膜流出,貯液粘度降低88.14 %,從而破壞果汁的膠體狀態。張來群等[7]將尼龍網經3-二甲氨基丙胺活化后,用戊二醛共價偶聯果膠酶,所得固定化酶Km值與自然酶接近,在較寬的pH值范圍內保持正常活力,對溫度的穩定性有較大提高。Vaillant等[8]以蝦殼幾丁質為載體,以戊二醛為偶聯劑共同固定PL和內切纖維素酶,發現其半衰期為407 h。

　　3.3固定化酶在啤酒澄清中的應用

　　啤酒以其清晰度高、泡沫適中、營養豐富和口感好成為人們的最佳選擇。但是,由于啤酒中含有一定量的蛋白質,它與游離于啤酒中的多酚、單寧等結合產生不溶性膠體或沉淀,造成啤酒混濁,從而嚴重影響了啤酒的質量。溫燕梅等[9]采用吸附—交聯法,使胰蛋白酶先吸附于磁性膠體粒子表面,后用戊二醛雙功能試劑交聯,形成“酶網”裹著載體形成固定化酶,該磁性酶對啤酒澄清防止冷渾濁有明顯效果。趙炳超等[10]在戊二醛做交聯劑的條件下,以介孔分子篩MCm248作載體固定化木瓜蛋白酶,所得固定化酶的熱穩定性有了顯著提高,固定化酶的pH值穩定性和儲藏穩定性也有了明顯改善。

　　3.4固定化酶在乳制品中的應用

　　乳糖酶亦稱為β-半乳糖苷酶,是工業中應用相當廣泛的一種酶,較多地應用于乳制品加工中。很多人小腸黏膜內的乳糖酶活性嚴重降低,導致乳糖不耐受癥。用乳糖酶處理部分乳糖,分解為葡萄糖和半乳糖,可以減少這種癥狀。

　　楊君等[11]應用海藻酸鈉—殼聚糖固定化乳酸菌進行發酵乳清飲料研究。結果表明,固定化乳酸菌產酸和耐酸能力強,菌種活力持久并可多次重復利用。孫玉梅等[12]埋酵母乳糖酶間歇處理預先超高溫消毒的牛奶,用戊二醛處理環狀芽孢桿菌的乳糖酶,或把該菌用戊二醛交聯固定于多孔硅膠,經處理或固定化后的乳糖酶,其生產活性從原來的21%提高至40%。李燕[13]用聚丙烯酰胺凝膠包埋米曲酶的乳糖酶,酶活力與機械強度都比較理想。固定化酶的穩定性范圍擴大,熱穩定性提高,同時底物乳糖在凝膠中擴散不影響固定酶的反應速度。使用該固定化酶處理脫脂牛奶,可以在保持原有風味的條件下,增加甜度,飲用時可減少蔗糖用量。

　　3.5固定化酶在制糖中的應用

　　在制備低聚果糖中,Hayashi等[14]用多孔硅石吸附Aureo-basidium sp.的果糖基轉移酶,并用戊二醛交聯后裝柱可保留較高的酶活力。Hayashi等[15]用DEAE-纖維素固定果糖基轉移酶,酶活力可保留95%。Yun等將果糖基轉移酶固定在苯乙烯衍生的多孔離子交換劑上填入玻璃柱內,初始固定化酶的活性僅喪失8%。Chiang等[16]將Aspergillus niger和Aspergillus japoicus的果糖基轉移酶純化后共價結合在甲基丙烯酰胺高分子顆粒上,可保留酶活力達100%。

　　固定化葡萄糖異構酶可以用來催化玉米糖漿和淀粉生產高甜度的高果糖糖漿。用淀粉生產高果糖漿包含3步:一是用淀粉酶液化淀粉;二是用糖化酶將其轉化為葡萄糖,即糖化;三是用葡萄糖異構酶將葡萄糖異構為果糖。由此可得到含高果糖漿與蔗糖同等甜度時,其價格低10%~20%,具有經濟推動力。該固定化酶常用的制備技術是熱處理法,將含葡萄糖異構酶的放線菌、芽孢桿菌或鏈霉菌等細胞用60~65 ℃熱處理15 min,該酶就固定在菌體上制成固定化酶[17]。

　　3.6固定化酶在茶葉加工中的應用

　　在茶葉中含有種類繁多的酶,如多酚氧化酶、過氧化酶、單寧酶、果膠酶等,其對茶葉的加工或深加工有重要的意義。對重要酶類的固定化研究,可有效地改善茶葉的品質、拓展茶葉深加工的領域和應用范圍。

　　多酚氧化酶是作為茶葉尤其是紅茶必不可少的一種酶,李榮林[18]等人利用海藻酸鈉包埋交聯后其活力保持不變,而且熱穩定性和對酸堿的適應性增強。單寧酶可以水解沒食子酸單寧中的酯鍵和縮酚酸鍵,將單寧酶應用于茶飲料中可改善茶飲料的品質。Lauren[19]報道用固定化的單寧酶處理紅茶,提高茶湯中可溶性鐵和鈣的含量。若在綠茶加工中使用單寧酶,可以部分消除夏秋茶的苦澀味道,提高茶飲料品質。茶葉中的水溶性果膠物質,對于促進紅茶的品質具有積極作用。尹軍鋒等[20]用果膠酶對茶汁酶解作用進行研究,得出了果膠酶能提高茶汁膜分離性能的結論。

　　3.7 固定化酶在煙葉中的應用

　　在烤煙初烤和復烤后尚殘留淀粉,淀粉在燃吸時影響燃燒速度和燃燒完全性,并產生糊焦氣味,影響吸食品質。在一定條件下淀粉能水解為水溶性糖,使煙質改善。但這些反應并不充分,處理后的煙葉中淀粉含量仍很高,特別是低次煙葉中較高的淀粉含量影響了該類煙葉的可用性。加酶處理能加速淀粉水解,能將直鏈淀粉迅速降解為糊精和麥芽糖等,糖化酶能將直鏈淀粉和支鏈淀粉降解為葡萄糖。劉謀盛等[21]將固定化α-2淀粉酶和糖化酶制成乳狀液,用以降低低檔次煙葉中淀粉的含量。由于酶被水溶性載體所形成的保護層包膜,避免了與空氣直接接觸,其活力得以提高,即強化了發酵條件,從而提高了卷煙的抽吸品質。同時,對固定化酶乳狀液添加劑與水溶液酶添加劑降低低檔次煙葉中淀粉的質量分數進行了研究,結果表明,固定化酶處理煙葉淀粉降解率為25%~30%,優于水溶液酶的25%,特別在抽吸品質方面,前者處理明顯優于后者處理。

　　3.8固定化酶在食品檢測以及傳感器中的應用

　　生物傳感器被認為是一種由受體、抗體或酶構成的生物感應層于換能器緊密連接而能提供環境組成信息的感應器。如:測量電流以及電位的酶電極,酶熱敏電阻裝置,以場效應管為基礎的生物傳感器,以及生物發光及化學發光為基礎的纖維—光學傳感器等,不同的傳感器都應用不同類型的固定化酶。

　　固定化葡萄糖氧化酶傳感器是其中應用最為廣泛的一種。1967年,Clark等[22]采用固定化酶技術,把葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上再和氧電極結合,組裝成第1個酶電極—葡萄糖電極。唐芳瓊等[23]利用納米顆粒引入到葡萄糖電極研究中,并用易成膜的PVB作輔助膜基質,進行GOD的固定化研究。試驗結果表明,利用納米顆粒的表面效應可以顯著提高GOD酶電極響應靈敏度。目前,制藥廠將葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶與一種顯色劑一起固定在試紙上,制成檢驗婦女是否妊娠的試紙。這種檢測技術簡單,操作方便,應用極為廣泛。用聚丙烯酰胺包埋葡萄糖氧化酶與氧電極組裝成酶電極也可用來進行臨床的血糖檢測,并且可連續測定1 000次血糖樣品,低溫存放180 d仍可保持90%的酶活力。

　　食品中的農藥殘留分析越來越受到人們的關注,蔬菜中有機磷農藥殘留的快速檢測已成為目前人們研究的熱點。應用有機磷農藥對膽堿酯酶特異性抑制的酶化學比色分析法已被廣泛應用于有機磷農藥的定性、定量檢測。于基成等[24]將植物酯酶共價結合到微孔塑料板上,制成農藥快速檢測板,用于檢測有機磷類農藥。建立的方法方便、快捷、檢測樣本容量大,結果能滿足蔬菜中有機磷農藥殘留檢測的要求。張淑平等[25]利用固定化的乙酰膽堿酯酶(AChE)制作一種可用于農藥殘留檢測的快捷靈敏的傳感器,并探討了AChE 的固定化技術。固定化酶傳感器具有較高的靈敏度和穩定性,該檢測方法可以滿足對甲萘威農藥殘留的快速檢測要求。

　　4固定化技術在食品工業中應用的前景和發展

　　固定化技術在食品工業中的應用還很多,如固定化氨基酰化酶生產L-谷氨酸;固定淀粉酶和葡萄糖淀粉酶以淀粉為原料生產葡萄糖;固定化酶法釀造調味品等,但用于食品工業的酶遠遠大于固定化酶。還有很多固定化酶和固定化細胞處于中試階段,固定化原生質克服了固定化細胞的一些缺陷,但固定原生質體還處于研究之中,未用于生產。人們清楚地看到了固定化技術的一些優點,雖然很多還處于研究和開發中,但已經給人們指明發展方向。隨著固定化技術的發展,將會有更多的固定化酶、細胞、原生質體應用于生產中,充分顯示出固定化技術的優越性,開啟固定化技術的新局面。

　　5參考文獻

　　[1] 李彥鋒,李軍榮,伏蓮娣.固定化酶的制備及應用[J].高分子通報,2001(2):13-17,23.

　　[2] 胡和兵,王牧野,吳勇民,等.酶的固定化技術及應用[J].中國釀造,2006(7):4-7.

　　[3] 張超,高虹,李冀新.固定化酶在食品工業中的應用[J].中國食品添加劑,2003(3):136-141.

　　[4]王璋.食品酶學[M].北京:輕工業出版社,2001.

　　[5] 胡慰望.食品化學[M].北京:科學出版社,1992:286-287.

　　[6] LOZANO P,MANJON A,ROMOJARO F,et al.A crossflow reactor with immobilized pectolytic enzymes for juice clarification[J].Biotechnology Letters,1987,9(12):875-880.

　　[7] 張來群,高天慧.尼龍網固定化果膠酶的制備及其性質的研究[J].生物化學雜志,1992,8(4):462-467.

　　[8] VAILLANT F,MILLAN A,MILLAN P.Co2immobilized pectinlyase and endocellulase on chitin and Nylon supports[J].Process Biochemistry,2000 (35):989-996.

　　[9] 溫燕梅,邱彩虹.吸附—交聯法固定胰蛋白酶及在澄清啤酒中的應用[J].湛江海洋大學學報,2001,12(4):42-46.

　　[10] 趙炳超,馬潤宇,石波.介孔分子篩MCm248 固定化木瓜蛋白酶性質的研究[J].食品發酵與工業,2005,31(10):60-63.

　　[11] 楊君,馮志彪.固定化乳酸菌發酵乳清飲料的研究[J].中國乳品工業,2007,35(6):34-37.

　　[12] 孫玉梅,朱蓓薇,牟連玉. 乳糖酶的應用及固定化[J].食品工業科技,1995(3):23-25.

　　[13] 李燕.乳糖酶的固定化及應用[J].山東輕工業學院學報,2003,17(3):52-56.

　　[14] HAYASHI S,NONOKUSHI M,IMADA K,et al.Production of a fruc-tosyl transferring enzyme by Aureobasidium sp.ATCC20524[J].J Ind Mi-crobial,1990,11(5):395-400.

　　[15] HAYASHI S,HAYASHI T,KINOSHITA J,et al.Immobilization of fruc-tofuranosidase from Aureobasidium sp. ATCC 20524 on porous silica[J].J Ind Microbiol,1992,15(9):247 -250.

　　[16] CHIANG CJ,LEE W C,SHEU D C,et al.Immobilization of β2 fruct-ofuranosidase from Aspergillus on methacrylamide2 based polymeric beads for production of fructooligosaccharides[J].Biotechnol Prog,1997, 13(4):577-582.

　　[17] 張斌,金莉.固定化酶及其在食品中的應用[J].食品添加劑,2006(1):147-150.

　　[18] 李榮林,方輝遂.多酚氧化酶固定化技術[J].茶葉科學,1997(S1):68-72.

　　[19] LAUREN S J.Chemical forms of iron,calium,magnesium and zine in black,oolong,green and instant black tea[J].J Food Sci,1988,53(1):181-184.

　　[20] 尹軍鋒,錢曉軍,羅龍新.果膠酶提高茶汁膜分離性能的研究[J].飲料工業,2000(6):30-33.

　　[21] 劉謀盛,王平艷,劉維涓,等.固定化酶降解煙葉中淀粉的研究[J].化學與生物工程,2007,24(5):42-44.

　　[22] CLARK T G,CRAIGHEAD H G.Avidin-biotin micropatterningmethods for biosensor applications[J].Biomedical Microdevices,2003,5(1):29-34.

　　[23] 唐芳瓊,孟憲偉,陳東,等.納米顆粒增強的葡萄糖生物傳感器[J].中國科學B輯,2000,30(2):119-124.

　　[24] 于基成,邊辭,薄爾琳,等.應用固定化酶檢測蔬菜中農藥殘留的方法研究[J].食品研究與開發,2007,28(4):137-140.

　　[25] 張淑平,單聯剛,經媛元,等.傳感器法檢測甲萘威殘留的研究[J].微納電子技術,2007(7/8):412-416