摘要：目的探討炮制因素對藥學甘草中藥學甘草苷和藥學甘草酸含量的影響。方法篩選適當提取方法，采用HPLC-DAD技術，ZorbaxSB-C18ODS反向色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，以0.1%(體積分數)甲酸溶液和甲醇為流動相，梯度洗脫，流速1.0ml•min-1，柱溫30℃，檢測波長250nm和276nm。測定了同一產地、同一批次的藥學甘草和炙藥學甘草中藥學甘草苷和藥學甘草酸的含量。
　　關鍵詞：藥學甘草論文;藥學甘草苷論文;藥學甘草酸論文;炮制論文;高效液相色譜論文
　　藥學甘草系豆科植物藥學甘草(GlycyrrhizauraienxisFisch)的根及根狀莖，俗稱靈草、蜜甘、蜜草、國老、甜草等，性味甘平，能調和諸藥，始載于《神農本草經》，被列為上品，是臨床上最常用的中藥之一。藥學甘草在中醫臨床應用中有藥學甘草和炙藥學甘草之分，其中藥學甘草指生藥學甘草,為原藥材除去雜質，洗凈、潤透切片、生用入藥者。炙藥學甘草又名炙草、蜜炙藥學甘草，為生藥學甘草片用蜂蜜拌勻，再炒至不粘手取出攤晾，然后入藥者[1]。
　　炮制是根據中醫藥理論，依照辨證施治用藥和藥物自身性質以及調制、制劑的不同要求所采取的一項制藥技術，是中醫藥學的一大特色[2]。在古代方劑中藥學甘草與炙藥學甘草應用區別明顯：藥學甘草性甘偏涼，長于瀉火解毒、化痰止咳;而藥學甘草經蜜炙后味轉甘溫，以補脾和胃、益氣復脈力勝。現代藥理學研究表明，炙藥學甘草能抗多種心律失常;藥學甘草和炙藥學甘草的調節免疫作用存在明顯的差異，蜜炙藥學甘草的調節免疫作用顯著強于藥學甘草。炙藥學甘草應為臨床補氣用藥學甘草的最佳炮制品，可調節機體的免疫功能[3]。由此可見，藥學甘草經炮制后理化性質發生變化，其性味功能也有所改變。我們以藥學甘草中最主要的2種有效成分藥學甘草苷(liquiritin)和藥學甘草酸(glycyrrhizicacid)為檢測指標，采用HPLC-DAD法比較藥學甘草炮制前后這2種成分含量的變化，從化學成分角度來探討中藥炮制的合理性、科學性。
　　1儀器與試藥
　　1.1儀器ShimadzuLC-10A高效液相色譜儀(日本島津)，包括SCL-10AvpSystemController、SPD-M20ADAD二極管陣列檢測器、LC-10ADvp泵、FCV-10ALvp四元低壓梯度洗脫系統、LC-Solution色譜數據工作站;梅特勒托利多AE240電子天平(瑞士MettlerToledo公司);Millipore超純水機;超聲波清洗器(型號SK250LH,上海科導超聲儀器有限公司)。甲醇(色譜純,美國J.T.Baker公司);水為超純水;其余試劑皆為分析純。
　　1.2試藥對照品藥學甘草苷(批號：06121824)及藥學甘草酸(批號：06110101)由上海同田生物科技有限公司提供。藥學甘草(批號：20071229;產地：甘肅)及炙藥學甘草(批號：20071229;產地：甘肅)藥材購自徐州醫藥股份有限公司中藥飲片廠，經徐州醫學院附屬醫院杜長俊副主任中藥師鑒定為真品。藥學甘草和炙藥學甘草為豆科植物藥學甘草的干燥根及根莖的炮制加工品。樣品憑證保存于我科。
　　2實驗方法與結果
　　2.1色譜條件色譜柱：ZorbaxSB-C18反向色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，流速1.0ml•min-1，柱溫30℃，檢測波長分別為250nm和276nm。進樣量：20μl，流動相:A為0.1%(體積分數)甲酸水溶液，B為甲醇，用前超聲脫氣30min，洗脫程序見表1。記錄65min色譜圖，見圖1～3。理論塔板數按藥學甘草苷和藥學甘草酸峰計應不低于4000。表1梯度洗脫程序
　　2.2對照品溶液的制備精密稱取藥學甘草苷對照品3.68mg、藥學甘草酸對照品2.46mg，用70%甲醇水溶圖1藥學甘草提取液250nm處HPLC圖譜(1.藥學甘草苷;2.藥學甘草酸)
　　圖2炙藥學甘草提取液250nm處HPLC圖譜(1.藥學甘草苷;2.藥學甘草酸)
　　圖3對照品溶液250nm處HPLC圖譜(1.藥學甘草苷;2.藥學甘草酸)
　　液溶解并定容于5ml棕色容量瓶中，得藥學甘草苷0.736g•L-1及藥學甘草酸0.492g•L-1的0號混合對照品標準貯備溶液。從中精密量取適量，用流動相配成藥學甘草苷濃度為0.368、0.184、0.092、0.046、0.0184、0.0092g•L-1及藥學甘草酸濃度為0.246、0.123、0.0615、0.03075、0.0123、0.00615g•L-1的1～6號混合對照品貯備液。
　　2.3供試品溶液的制備精密稱取藥學甘草粉末及炙藥學甘草粉末(過60目篩，烘干至恒重)各0.2g，置具塞錐形瓶中，精密加入20ml70%甲醇，稱定重量，室溫放置1h后超聲處理(功率250W，頻率40kHz)40min，取出錐形瓶擦干后放冷到室溫，再稱重，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，上清液經0.45μm濾膜濾過，取續濾液供HPLC分析。
　　2.4方法學考察
　　2.4.1線性關系考察精密吸取“2.2”項下已制備的各不同濃度的混合標準貯備液(0～6號)20μl注入色譜儀，測定峰面積，以藥學甘草苷或藥學甘草酸濃度(g•L-1)為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，進行線性回歸,得直線回歸方程，見表2。表2線性關系實驗結果(n=7)
　　2.4.2檢測限和定量限取0號混合對照品標準貯備液，用0.1%甲酸水溶液-甲醇(70∶30)依次稀釋制成一系列由高到低的梯度濃度溶液并進樣分析，測定峰面積約為噪聲10倍(S/N=10)時的進樣濃度為定量限(QOD)，測定峰面積約為噪聲3倍(S/N=3)時的進樣濃度為檢測限(LOD)。結果藥學甘草苷和藥學甘草酸的QOD分別為0.0069mg•L-1和0.0077mg•L-1，LOD分別為0.0023mg•L-1和0.0031mg•L-1。
　　2.4.3精密度試驗精密移取1號混合標準貯備液20μl，重復進樣6次(2次進樣之間間隔約30min)，測定峰面積，結果藥學甘草苷平均峰面積相對標準偏差(RSD)=0.498%，藥學甘草酸平均峰面積RSD=0.742%;精密移取1號混合標準貯備液20μl，連續分析6天，每天進樣1次，測定峰面積，結果藥學甘草苷平均峰面積RSD=1.67%，藥學甘草酸平均峰面積RSD=2.71%。結果表明儀器精密度良好。
　　2.4.4重現性試驗取炙藥學甘草樣品6份，按“2.3”項下供試品溶液的制備方法處理，制成6份供試品溶液，按“2.1”項下方法測定，結果藥學甘草苷平均含量為0.09683g•L-1，RSD=1.83%;藥學甘草酸平均含量為0.1358g•L-1，RSD=2.36%。結果表明此方法重現性良好。
　　2.4.5穩定性試驗取同一份炙藥學甘草樣品溶液。在配制后0、2、4、6、8、12、24h進樣，測定峰面積，結果藥學甘草苷平均峰面積RSD=0.827%，藥學甘草酸平均峰面積RSD=0.964%。結果表明24h內樣品溶液穩定。
　　2.4.6回收率試驗精密移取0.2ml已知藥學甘草苷及藥學甘草酸含量的炙藥學甘草樣品溶液9份，每3份分別精密加入藥學甘草苷濃度為0.1g•L-1及藥學甘草酸濃度為0.14g•L-1的混合對照品溶液0.16、0.20、0.24ml，按“2.1”項下方法同時測定藥學甘草苷和藥學甘草酸的含量，結果見表3、4。表3藥學甘草苷加樣回收率測定結果表4藥學甘草酸加樣回收率測定結果
　　2.5不同樣品中藥學甘草苷和藥學甘草酸含量測定取藥學甘草和炙藥學甘草樣品各6份，按照“2.3”項下方法制備，按“2.1”項下方法測定。統計分析：計量資料以±s表示，以t檢驗比較組間差異，結果見表5。結果表明，藥學甘草經蜜炙后藥學甘草苷和藥學甘草酸的含量均增加(P<0.01)。表5不同樣品中藥學甘草苷和藥學甘草酸含量測定
　　3討論
　　3.1提取溶劑的選擇我們比較了80%氨性甲醇提取后酸化定容、80%甲醇、70%乙醇(中國藥典2005版測定藥學甘草苷的提取溶劑)、70%甲醇對藥學甘草苷和藥學甘草酸的提取效率及色譜峰峰型的影響，其中70%甲醇效果相對略好，又考慮到流動相采用甲醇-0.1%甲酸水溶液，因此，采用70%甲醇冷浸超聲提取。
　　3.2檢測波長的選擇采用DAD檢測器，在完成色譜數據采集后，可在不同的提取波長下進行定量分析。參考中國藥典2005版規定的藥學甘草苷和藥學甘草酸的檢測波長，再結合藥學甘草苷和藥學甘草酸的DAD全波長掃描圖譜，最終選擇276nm為藥學甘草苷的檢測波長，250nm為藥學甘草酸的檢測波長。
　　3.3流動相系統的選擇藥學甘草的成分復雜，為盡可能地使藥學甘草成分達到較好的分離效果，我們對實驗條件進行了一系列優化。流動相方面，試驗了乙腈-水[4]、甲醇-水、乙腈-甲醇-水等，發現當流動相中有乙腈時，出峰較晚的組分分離效果不佳，且乙腈試劑昂貴，毒性大，選用甲醇-水二元系統進行分離測定，可使待測組分和干擾組分較有效分離。由于藥學甘草酸為有機弱酸，且易解離，峰形拖尾，因此，考慮在流動相中加入一定量的酸作為抑制劑，之所以用甲酸而不用冰醋酸[1]、磷酸[4-5]、磷酸緩沖鹽等，是考慮到后續可直接采用已建立的流動相條件進行液質聯用分析及對色譜柱的保護。總之，選擇0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動相，簡單、經濟、有效。
　　3.4固定相的選擇預實驗考察了大連依利特HypersilODS2、大連依利特KromasilC18(250mm)、大連依利特KromasilC18(150mm)、大連依利特HypersilBDSC18、島津Shim-PackCLC-ODS、安捷倫ZorbaxSB-C18ODS等色譜柱，結果發現，ZorbaxSB-C18ODS色譜柱給出的藥學甘草苷和藥學甘草酸的峰形及分離度均較好。
　　3.5柱溫的選擇在確定固定相和流動相的情況下，分別考察了25、30、35℃柱溫，預實驗結果表明30℃柱溫下峰形及分離度較好。
　　3.6炮制因素對藥學甘草苷和藥學甘草酸影響的分析為使測定結果更準確地反映炮制因素引起的化學成分變化，我們選用了正在上市銷售的同一產地、同一批次的藥學甘草和炙藥學甘草藥材。檢測結果表明，炮制因素可顯著增加藥學甘草中藥學甘草苷和藥學甘草酸的含量。其原因可能是藥學甘草苷和藥學甘草酸熱穩定性好，藥學甘草經蜜炙后蜂蜜充分滲入藥學甘草組織內部置換出部分水分，且蜂蜜覆蓋于藥學甘草表面能防止空氣中氧及二氧化碳與藥學甘草中有效成分發生化學反應，有效延長了藥學甘草的貯藏時間。由此可推斷中醫用藥講究炮制，目的是利用多種輔料的助溶作用或成分結構發生變化，提高有效成分的檢出率，從而提高療效，改變適應證。
　　【參考文獻】
　　[1]崔淑芬,張信青,FrankSCL,等.HPLC指紋圖譜應用于炙藥學甘草的炮制研究[J].中成藥,2007,29(11):1636-1639.
　　
　　[2]王國喜,門闖.淺談中藥炮制[J].河南中醫,2008,28(12):89-89.
　　
　　[3]王明喜,石志強.生藥學甘草炙藥學甘草臨證應用考辨[J].實用中醫內科雜志,2005,19(4):383.
　　
　　[4]閆永紅,段天璇,王文全,等.野生及栽培藥學甘草HPLC指紋圖譜[J].中國天然藥物,2006,4(2):116-120.