摘要：葡萄酒中檸檬酸的檢測(cè)方法有很多，其中應(yīng)用比較多的有：高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、酶法、微電子溶出法、化學(xué)法等等。本文主要就褪色分光光度法對(duì)葡萄酒中檸檬酸的含量的測(cè)定方法進(jìn)行詳細(xì)介紹，以供讀者參考。
　　關(guān)鍵詞：葡萄酒；檸檬酸；褪色分光光度法
　　一、褪色分光光度法測(cè)定檸檬酸含量的原理
　　褪色分光光度法測(cè)定檸檬酸含量的原理是：使用Fe（III）—磺基水楊酸作為指示劑，當(dāng)Fe（III）—磺基水楊酸處于pH為4.2—4.6的酸性溶液中時(shí)會(huì)生成紫紅色的絡(luò)合物，當(dāng)向溶液中加入檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)液或是含有一定量的檸檬酸溶液時(shí)，生成的紫紅色絡(luò)合物會(huì)褪色至橙黃色。然后在470nm處進(jìn)行吸光度的測(cè)定，吸光度的減小的值與檸檬酸的含量在一定的范圍內(nèi)是成正比的，根據(jù)這種方法可以將試樣中的檸檬酸進(jìn)行定量分析。
　　二、實(shí)驗(yàn)所用的儀器
　　1754型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司
　　2DT-100單盤(pán)天平北京光學(xué)儀器廠(chǎng)
　　3PHS-3C精密酸度計(jì)成都方舟科技開(kāi)發(fā)公司
　　三、儀器條件的選擇
　　本次實(shí)驗(yàn)的儀器選擇方面主要在于對(duì)分光光度計(jì)和PHS-3C精密酸度計(jì)的選擇上，由于實(shí)驗(yàn)的方法需要進(jìn)行吸光度的測(cè)定，因此需要使用靈敏性高的紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。PHS-3C精密酸度計(jì)可以準(zhǔn)確的將溶液的pH測(cè)定出來(lái)，本實(shí)驗(yàn)需要將反應(yīng)的pH進(jìn)行精確測(cè)定，因此需要使用。DT-100單盤(pán)天平的使用主要是在試劑的配置時(shí)需要。
　　四、實(shí)驗(yàn)所需試劑
　　所用試劑均為分析純，所用水均為去離子水。
　　1Fe3+溶液(1.000×10-2mol•L-1)：稱(chēng)4.8220gNH4Fe(SO4)2•12H2O，用0.025mol•L-1HCLO4溶解，加水定容至1000mL。
　　2磺基水楊酸溶液(1.000×10-2mol•L-1)：稱(chēng)磺基水楊酸2.5420g，用0.025mol•L-1HCLO4溶解，加水定容至1000mL。
　　3HAc-NH4Ac溶液：取冰HAc28mL，加500mL水稀釋?zhuān)�然后用濃氨水調(diào)溶液pH至4.5為止。HCLO4溶液(1.0×10-2mol•L-1)。
　　4葡萄酒試樣：取1mL葡萄酒液定容于100mL的容量瓶中進(jìn)行稀釋100倍。
　　五、褪色分光光度法的測(cè)定方法
　　1在25mL的比色管中分別加入剛配置好的新鮮的Fe（III）溶液1.0mL、磺基水楊酸溶液4.0mL和HAc-NH4Ac緩沖液4.0mL，水定容至刻度，邊定容邊輕輕搖勻。
　　2放置10min后，使用1.0cm的比色皿，以蒸餾水作為對(duì)照，在470nm處進(jìn)行吸光度的測(cè)定，得到磺基水楊酸鐵絡(luò)合物的吸光度A1。
　　3取另一只25mL的比色管，與上述操作相同，不過(guò)注意在定容前先加入0.5mL稀釋了的葡萄酒試樣，然后進(jìn)行470nm處的吸光值的測(cè)定，測(cè)得的吸光值為A2，即為褪了色的磺基水楊酸鐵絡(luò)合物。
　　4進(jìn)行計(jì)算，根據(jù)ΔA=A1-A2進(jìn)行計(jì)算。
　　5檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制。按上面的方法，僅在加入試樣時(shí)改為加入檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)液，依次為0.0mL,0.2mL,0.4mL,0.6mL,0.8mL,1.0mL。分別測(cè)其吸光值，并求出與之相對(duì)應(yīng)的褪色吸光值差ΔA的值，然后輸入Excel中進(jìn)行檸檬酸溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制，并求出相應(yīng)的回歸方程，得到的方程為：
　　ΔA=0.6294a+0.0396，其中a是檸檬酸的含量，單位為mg/25mL。其適用范圍為0—40μg/mL。相關(guān)系數(shù)是0.9923，大于所要求的臨界值標(biāo)準(zhǔn)0.917，說(shuō)明了此回歸方程有效。回歸方程制作成表格，如下表：
　　
　　6然后根據(jù)上一步得到的葡萄酒試樣的ΔA值進(jìn)行代入回歸方程：ΔA=0.6294a+0.0396中，求出a，即為葡萄酒試樣中的檸檬酸含量。
　　六、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)考慮的問(wèn)題
　　1測(cè)定波長(zhǎng)的選擇
　　為了選擇最佳的測(cè)定波長(zhǎng)，試驗(yàn)在前期做了一系列的預(yù)實(shí)驗(yàn)，其中很重要的一個(gè)方面是測(cè)定波長(zhǎng)的選擇。由于紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)十分靈敏，測(cè)定波長(zhǎng)稍一改變就會(huì)對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果產(chǎn)生巨大的影響，因此在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前一定要確定最佳的測(cè)定波長(zhǎng)，即所謂的最大吸收波長(zhǎng)。
　　預(yù)實(shí)驗(yàn)的方法是：與上面的實(shí)驗(yàn)原理和方法大致相同，只是在進(jìn)行紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定時(shí)，測(cè)定波長(zhǎng)分別選擇：440nm，450nm，460nm，470nm，480nm，490nm，500nm，510nm。在這幾個(gè)波長(zhǎng)下進(jìn)行磺基水楊酸鐵的絡(luò)合物以及顯色劑的吸收關(guān)譜，得到的結(jié)果如下表。
　　
　　表中可以看出，當(dāng)測(cè)定波長(zhǎng)為470nm時(shí)，所得的絡(luò)合物、顯色劑以及ΔA的吸光值都是最大的，因此本實(shí)驗(yàn)就采用470nm作為檸檬酸含量測(cè)定的測(cè)定波長(zhǎng)。
　　2顯色的pH的范圍
　　顯色的pH的選擇也很關(guān)鍵，因?yàn)樗�選的指示劑Fe（III）—磺基水楊酸只有在一定范圍的酸性溶液中才能生成相應(yīng)的絡(luò)合物才能進(jìn)行一下步驟的操作，因此實(shí)驗(yàn)前確定實(shí)驗(yàn)溶液所需的pH值的范圍很有必要。
　　pH值的范圍確定也是通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確定的。實(shí)驗(yàn)方法同上，只是將溶液的pH進(jìn)行改變，分別取pH為：3.9,4.0,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：當(dāng)pH在4.2—4.6時(shí)，所得的絡(luò)合物顏色鮮艷，而且所測(cè)得的ΔA值較大并且穩(wěn)定，因此，在測(cè)定時(shí)應(yīng)選擇的pH值范圍是：4.2—4.6。其中，當(dāng)pH值為4.5時(shí)，所測(cè)的ΔA值最大且最穩(wěn)定，因此本實(shí)驗(yàn)選擇pH為4.5來(lái)進(jìn)行測(cè)定。
　　3試劑的用量
　　3.1磺基水楊酸和Fe離子的用量選擇
　　磺基水楊酸和Fe離子作為整個(gè)實(shí)驗(yàn)的指示劑，其用量多少的選擇是非常關(guān)鍵的，因此也需要通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確定。方法依舊同上，只是將磺基水楊酸的用量進(jìn)行改變，磺基水楊酸的量分別選取：3.0mL，3.5mL，4.0mL，4.5mL，5.0mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)選取磺基水楊酸的量為4.0mL時(shí)，實(shí)驗(yàn)所得的ΔA值最大而且最為穩(wěn)定，因此本次實(shí)驗(yàn)所選取的磺基水楊酸的量即為4.0mL。磺基水楊酸的量一旦確定，根據(jù)絡(luò)合物的化學(xué)反應(yīng)可知所需的鐵離子的量也是4.0mL。
　　3.2緩沖劑的用量的選擇
　　緩沖溶液也是實(shí)驗(yàn)成敗、結(jié)果準(zhǔn)確與否的一個(gè)重要因素，緩沖溶液加的太多會(huì)稀釋指示劑和試樣的量，造成結(jié)果過(guò)小或是檸檬酸含量過(guò)低而不能夠被檢測(cè)到，ΔA值很小；但是緩沖液加的太少會(huì)使整個(gè)系統(tǒng)的pH值變化劇烈，使得絡(luò)合物的性質(zhì)等都不穩(wěn)定，測(cè)得的結(jié)果自然更加不準(zhǔn)確。

 1/2    1 2 下一頁(yè) 尾頁(yè)