強化生物除磷技術(Enhanced Biological Phosphorus Removal，簡稱EBPR)已成為生物除磷的重要途徑，日益受到學者們的關注。EBPR是以富集的聚磷菌(PAOs)在厭氧條件下吸收VFA用于細胞內合成PHA并且釋放磷，好氧條件下分解PHA提供能量同時過量吸磷，通過排泥達到除磷的目的[1]。

　　摘 要：以富含90%±2%純度聚磷菌(PAOs)的強化生物除磷系統(EBPR)為研究對象，考察了10℃厭氧、10℃好氧、20℃厭氧、20℃好氧4種運行條件下PAOs的衰減特征。結果表明：溫度越高對應衰減速率越快，4個系統在1～9 d里衰減速率的平均值分別為：10℃厭氧：0.053/d;10℃好氧：0.050/d;20℃厭氧：0.072/d;20℃好氧：0.145/d。其中 4個系統由于細胞死亡引起的活性衰減速率分別為：10℃厭氧：0.019/d;10℃好氧：0.017/d;20℃厭氧：0.019/d;20℃好氧：0.03/d，占總活性衰減的比例分別為：35.8%、34%、26.4%、20.7%。在9 d饑餓衰減期間，污泥中所含PHA與糖原的量總體呈下降趨勢。相同溫度下，糖原在厭氧衰減過程中降解速率大于好氧;在同樣的厭氧、好氧衰減條件下，溫度越高糖原降解速率越快。

　　關鍵詞：期刊論文發表,聚磷菌,強化生物除磷,衰減速率,LIVE/DEAD染色,聚羥基烷酸,糖原

　　EBPR的設計大多是以ASM2號模型為基礎，PAOs衰減速率作為模型中最重要的參數之一，獲得其準確的數值對建立完善、實用的數學模型具有重要意義，同時對EBPR生物處理過程的設計和運行管理、控制策略也具有借鑒意義[24]。水溫的變化對于微生物衰減速率有重要的影響[5]，在實際污水處理廠運行過程中主要面臨的問題也是季節溫差變化較大，尤其是中國北方大部分地區水溫波動較大。目前對于EBPR系統衰減特征的研究主要是環境溫度恒定在20℃左右，Lu等[6]采用PAOs純度達到 85%的EBPR系統為研究對象，考察了22℃條件下PAOs在厭氧、缺氧、好氧的衰減過程，Hao等[7]考察了同樣是恒定環境溫度在22±0.5℃的條件下PAOs和聚糖菌(GAOs)好氧條件下的衰減特征，而目前對于低溫下PAOs的衰減特征的研究未見報道。所以本文采用已運行340 d的EBPR系統內種泥，考察不同溫度對PAOs在厭氧和好氧條件下的衰減特性，并結合現代分子生物學的手段鑒定分析細胞死亡引起的數量衰減所占比例 [8]。

　　苗志加，等：不同溫度及厭氧/好氧運行條件對聚磷菌衰減特性的影響

　　1 材料與方法

　　1.1 衰減速率試驗裝置及運行方式

　　衰減速率試驗在3 L抽濾瓶中進行，取已富集PAOs濃度達到90%以上的EBPR系統內好氧結束時刻的種泥，持續曝氣5 h后平均分裝在4個小試反應器內，加入不含碳源的配水定容為2 L，采用磁力攪拌器進行攪拌，其轉速為100 r・min-1。1#，2#反應器放置在10℃恒溫培養箱，3#、4#放置在20℃恒溫培養箱。1#、3#為厭氧條件，試驗過程中曝氮氣以保證厭氧環境。 2#、4#為好氧條件，控制空氣流量為0.1 m3/h保證溶解氧在2.0以上。

　　4個反應器分別在第0、0.5、1、3、5、7、9 d取250 mL泥水混合物，6 000轉離心5 min，用配水清洗2遍離心后放入500 mL錐形瓶中，加入0.127 5 g乙酸鈉(200 mgCOD)，配水補足500 mL，厭氧攪拌1 h，測定期間的磷釋放速率。在運行的9 d內每天取泥樣，測污泥濃度、PHA、糖原的變化。

　　1.2 試驗水質

　　配水配方如下[9]：NH4Cl 1.02 g・L-1，MgSO4・7H2O 1.20 g・L-1，CaCl2・2 H2O 0.19 g・L-1，ATU(硝化抑制劑) 7.94 mg・L-1，微量元素溶液4 ml・L-1，其中微量金屬元素成分為： FeCl3・6H2O 1.5 g・L-1，H3BO3 0.15 g・L-1，CuSO4・5H2O 0.03 g・L-1，KI 0.18 g・L-1，MnCl2・4H2O 0.12 g・L-1，Na2MoO4・2H2O 0.06 g・L-1，ZnSO4・7H2O 0.12 g・L-1，CoCl2・6H2O 0.15 g・L-1，乙二胺四乙酸(EDTA)10 g・L-1。4個反應器內加入Trisbuffer使系統維持pH值穩定在7.5左右。

　　1.3 試驗種泥

　　試驗種泥采用已乙酸/丙酸交替運行340 d的EBPR系統內污泥，通過熒光原位雜交(FISH)結果分析，其PAOs的純度高達90%±2，污泥齡(SRT)：10 d。

　　1.4 LIVE/DEAD 活死細胞鑒定

　　1.4.1 常規檢測方法 實驗所用常規檢測方法見水和廢水監測分析方法(第4版)[10]。PHA及其組分采用氣相色譜法[11];VFA采用氣相色譜法。

　　1.4.2 LIVE/DEAD活死細胞鑒定 采用LIVE/DEADR BacLightTM(moleculer probes，L7012)試劑盒測定第0、0.5、1、3、5、7、9 d的泥樣中活死細胞的變化情況。該試劑包括綠熒光核酸染料SYTOR9和紅色熒光染料PI(propidium iodide)2中熒光染料，與待測樣品孕育一定時間后，具有完整細胞壁的活細胞顯綠色，細胞壁已經破損的的死細胞顯紅色。

　　染色步驟對試劑盒的方法進行了優化，每次取待測泥樣15 mL，去離子水清洗1遍后離心后倒去上清液，采用0.85%的NaCl浸泡1 h，期間隔10 min上下顛倒一次。取1 mL經預處理的泥樣與2 mL離心管內，分別加入0.5 μL 的SYTOR9 和05 μL 的PI染料，混合均勻后在暗處放置15 min，期間上下混勻2～3次。取10 μL已染色的泥樣制作玻片，在熒光顯微鏡下觀測拍照30組照片。同一視野內照紅綠兩組熒光照片，通過AxioVision軟件對照片做灰度分析并結合 IPP軟件的計數分析，得出綠色和紅色熒光所占的比例，即活死細胞所占的比例。 　　1.5 衰減速率的計算

　　對0、0.5、1、3、 5、7、9 d的磷釋放速率的對數值做線性回歸分析，計算公式如下：R0為未衰減初始時刻磷釋放速率，Rt為衰減后某一時刻磷釋放速率，td為衰減時間[12]。細胞活性衰減通過對0、0.5、1、3、5、7、9 d死細胞比例進行回歸線性計算，得到其衰減數值[6]。

　　b=-lnRcR0×1td

　　2 試驗結果與討論

　　2.1 不同溫度對PAOs厭氧好氧衰減速率的影響

　　圖1為4個反應器在不同溫度下厭氧衰減和好氧衰減過程中磷釋放速率的變化�？梢钥闯鲈谒�減開始后的1 d內4個系統其活性沒有下降反而都略有上升，在其后的8 d里活性平緩下降，此實驗現象未見報道。分析可能的原因是本研究所用種泥中含有少量顆�；�污泥，在衰減初始的第1 d內這部分顆�；�污泥自溶，不僅提供了少量碳源基質也使顆粒內PAOs溶出，使得系統中PAOs的相對活性增加;也有可能是種泥細胞內存儲的能源底物還沒有完全消耗掉，第1 d內并沒有造成實際意義上的衰減。

　　設定第1 d為初始R0，對1～9 d 內4個系統釋磷速率的對數值做線性回歸，結果如圖2所示，得到期間10℃厭氧、10℃好氧、20℃厭氧、20℃好氧對應PAOs的平均衰減速率分別為：0053、0050、0072、0145/d。HAO等[6]在22℃±2的好氧條件下，測得7 d內PAOs的平均衰減速率為0113/d，與本試驗結果比較，這個數值低于本試驗中20℃好氧所得衰減速率，這可能是由于他們所用種泥的SRT為12 d，略高于本實驗中的10 d，長SRT條件下運行的系統可能會培養出更耐饑餓的菌種[13]。由圖1可以看出從第5 d開始20℃條件下的2個系統衰減速率開始迅速下降，通過式(1)計算，5～9 d內20℃厭氧、20℃好氧對應PAOs的平均衰減速率分別為：0.081、0.199/d，見表1。而在此期間10℃條件下衰減速率并無明顯變化且好氧與厭氧衰減速率具有相似的數值。由此可以看出不同溫度對PAOs在厭氧和好氧的衰減代謝有重要影響，溫度越高衰減速率越快。低溫條件(10℃)下好氧衰減速率與厭氧衰減速率差別不大，常溫(20℃)條件下好氧衰減速率大于厭氧衰減速率。

　　2.2 不同溫度下PAOs厭氧好氧細胞活性鑒定

　　在污水生物處理過程中，微生物的衰減包括細胞的死亡和功能性微生物活性的喪失，然而在大多數學模型和文獻報道中，細胞衰減被單一的認為是細胞死亡引起的數量衰減，對于細胞活性衰減并沒有特意區分[3，14]，試驗研究中利用LIVE/DEAD試劑盒鑒定0～9 d內死活細胞數量的變化，通過軟件分析得到活細胞所占比例，結果如圖3所示。通過線性回歸分析得出，PAOs在不同溫度好氧與厭氧條件下的衰減速率。

　　由圖3可知，溫度對微生物生理代謝有直接的影響，溫度越高微生物代謝活性越快，同時在饑餓衰減的條件下，污泥中有一部分細胞會發生自溶并產生少量外源底物[15]，PAOs可以利用這一部分底物合成細胞內貯存底物，維持活性或二次生長。溫度越高細胞自溶數量越多，細胞死亡所占衰減速率的比例越低，計算結果見表1。在不同溫度厭氧條件下的2個系統細胞活性衰減速率一致，都為0.019/d，不同溫度好氧條件下PAOs細胞活性衰減速率數值對比比較明顯，10℃與20℃的溫度下其數值分別為：0.017、0.30/d。由此可得出好氧條件下PAOs的細胞活性衰減隨溫度升高而加快，但是厭氧條件下 10℃與20℃沒有變化。通過計算可得10℃厭氧、10℃好氧、20℃厭氧、20℃好氧4個系統內細胞死亡所占的衰減比例分別為：35.8%、34%、 26.4%、20.7%。

　　2.3 不同溫度下PAOs內碳源代謝變化

　　聚羥基烷酸(PHA)和糖原作為PAOs細胞內貯存的能源物質，在饑餓狀態下對細胞的衰減起著重要的作用，圖4、圖5顯示4個系統PHA與糖原的變化情況。由圖4可知，1#(10℃厭氧)與3#(20℃厭氧)系統PHA濃度在第0～2 d的變化趨勢相似，均迅速降低; 10℃條件下第7 d出現的最小值：1.094 mg PHA/g VSS，20℃條件下第2 d出現最小值：1.24 mg PHA/g VSS，本實驗結果得到的最低PHA含量與Temmink等[16]在低碳源負荷下得到1.55 mg PHA/g VSS的數值接近。1#(10℃厭氧)系統2～9 d內維持在最小值略有波動，而3#(20℃厭氧)系統在2～9 d里其數值不下降反而升高，在第6 d達到了9.778 mg PHA/g VSS ，分析原因可能是在與10℃相比20℃厭氧衰減過程中，細胞自溶的量更大，給PAOs提供了外碳源從而合成細胞內的PHA。而 Lopez等[17]的研究結果表明，在20±2℃下PAOs厭氧衰減過程中PHA含量在第1 d就達到最小值：5.2 mg PHA/g VSS，7 d內并無明顯變化，這與1#系統內變化趨勢相似，而與3#系統差異較大。這可能與污泥性質與馴化過程不同有關，本試驗采用乙酸/丙酸交替運行，已富集到純度達90%±2聚磷菌，而Lopez采用乙酸為單一碳源富集的PAOs純度較低，菌群結構更加復雜。

　　好氧條件下，2#與4#系統在起始衰減階段由于PHA可以被氧化提供能量，在0.5 d內其含量便迅速降低，如圖4所示。10℃條件下衰減，PAOs中PHA含量略高于20℃條件下的數值，其1～9 d的平均值分別為：1.97 mg PHA/g VSS，0.43 mg PHA/g VSS。

　　衰減過程中糖原的變化如圖5所示。在0～1 d不同溫度條件下，厭氧衰減過程中糖原濃度降低，好氧衰減過程中糖原濃度升高，4個反應器內糖原的變化符合典型的PAOs代謝模型[18]：厭氧條件下糖原被分解為丙酮酸同時供還原力生成PHA，濃度下降;好氧條件下一部分PHA重新轉化為糖原，濃度升高。Lu等[6]研究結果表明，PAOs在20±2℃ 下厭氧衰減，在0～2 d內細胞生長代謝所需的ATP由糖原與聚磷顆粒一起提供，而在2～8 d期間主要是聚磷顆粒產生ATP，糖原濃度浮動較小。然而本實驗在1～9 d期間，4個系統內糖原濃度均呈下降趨勢，且下降幅度較大，這與Lu等研究結果差異較大。分析原因可能是，種泥起始狀態中所含糖原濃度不同，本實驗所用種泥中糖原濃度含量更高，在饑餓條件下糖原作為能源物質分解用來提供細胞代謝的能量。在整個衰減試驗過程中：同樣溫度下，糖原的厭氧降解速率大于好氧降解速率;在厭氧、好氧的衰減過程中，溫度越高糖原降解速率越快。 　　3 結 論

　　1) 考察了在10、20℃條件下PAOs厭氧、好氧衰減速率，結果表明溫度越高衰減速率越明顯。在初始階段由于種泥中一部分顆粒污泥破碎，4個系統在衰減1 d后釋磷活性反而升高，在1～9 d里釋磷速率逐漸下降，其平均值分別為：1#(10℃厭氧)：0.053/d;2#(10℃好氧)：0.050/d;3#(20℃厭氧)：0.072 /d;4#(20℃好氧)：0.145/d。

　　2) 通過LIVE/DEAD試劑盒鑒定0～9 d衰減期內細胞的活性，測得4個衰減系統內由細胞死亡所引起衰減速率為：10℃厭氧：0.019/d;10℃好氧：0.017/d;20℃厭氧：0.019/d;20℃好氧：0.03/d，溫度越高細胞死亡引起的活性衰減占總活性衰減比例越低，其比例分別為：35.8%、34%、26.4%、 20.7%。

　　3) 在10、20℃溫度條件下的厭氧、好氧衰減的4個系統中，細胞內所貯存的PHA與糖原被分解用來提供能量，在9 d衰減過程中其濃度總體均呈現下降趨勢。相同溫度下，糖原在厭氧衰減過程中降解速率大于好氧;在同樣的厭氧、好氧衰減條件下，溫度越高糖原降解速率越快。

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