摘要:核小體定位是參與真核生物基因表達調控的一種重要的表觀遺傳因素,深刻影響基因轉錄､DNA復制與修復等生物學過程｡對于在許多基因位點,比如轉錄起始位點(TSS)､轉錄因子結合位點(TFBS)等處的核小體定位已有不少報道｡主要介紹了核小體的定位特性,綜述了轉錄起始位點處核小體的定位特征, 分別從序列依賴性因素和DNA甲基化､組蛋白變體及修飾､染色質重塑､可變剪接等表觀遺傳因素較為詳細地概括了轉錄起始位點核小體定位的研究進展｡

　　關鍵詞:核心期刊論文,表觀遺傳,序列依賴性,轉錄起始位點(TSS),核小體定位

　　Advances on Nucleosome Mapping Around TSS

　　WANG Cheng-ai

　　(School of Mathematics,Physics and Biological Engineering,Inner Mongolia University of Science and Technology,Baotou 014010,Inner Mongolia,China)

　　Abstract: Nucleosome mapping,an important epigenetic factor participating in regulating eukaryotic gene expression, deeply affects lots of biological processes,including gene transcription,DNA replication,DNA repair and so forth. The nucleosome mapping around TSS and TFBS has been reported properties of nucleosome mapping were introduced in this paper. Features in nucleosome mapping around TSS were summarized. Advances on nucleosome mapping around TSS from both the DNA sequence-dependent factor and some epigenetic factors including DNA methylation, variants and modification of histone,chromation remodeling,alternative splicing were reviewed.

　　Key words:epigenetic; DNA sequence-dependent; TSS; nucleosome mapping

　　核小體是真核生物中染色質的基本組成單位,而核小體定位是目前生命科學,特別是表觀遺傳學研究領域的一個熱點問題｡核小體是由核心DNA約147 bp,纏繞在組蛋白八聚體周圍約1.65圈而成,串聯并進一步折疊成為染色質纖維[1]｡研究發現,真核生物基因組DNA有3/4以上被核小體所占據｡可以這樣說,核小體定位是指核小體在基因組上的位置,通過控制蛋白結合位點等因素參與基因轉錄調控過程｡一些順式作用元件比如Poly A序列､GC含量和序列模體等,是影響低等真核生物中核小體定位的主要因素,而高等生物核小體多數服從統計定位[2]｡核小體定位受到DNA序列因素的影響,但很多研究表明表觀遺傳因素對核小體定位同樣起著重要的作用｡很多研究報道轉錄起始位點(TSS)序列外顯子處核小體占據率高于內含子,DNA轉錄位點基因間區､啟動子､5′NFR等處核小體分布較少｡鑒于此,有研究認為AA/TT/TA是核小體定位密碼[3],鄰近核小體､染色質高級結構也影響核小體定位｡一些表觀遺傳因素引起的DNA結構多樣性,也同樣影響核小體定位[4]｡然而,多種因素導致的基因功能位點附近核小體的有無或者位置的不同均會影響基因表達調控｡

　　1轉錄起始位點核小體定位研究概況

　　核小體定位是一種重要的表觀遺傳因素,影響基因表達調控;而對于轉錄起始位點附近的核小體定位特征研究的也比較多｡目前,研究人員做了關于人類以及酵母基因組的數據分析,發現核小體定位有重要的偏好性序列特征,TSS處核小體定位參與基因的轉錄調節,也與一些非組蛋白因子的影響有關｡Li等[5]通過研究小鼠肝臟的核小體定位圖譜,發現DNA上核小體的定位能夠調節基因轉錄水平｡

　　1.1轉錄起始位點核小體定位的特征

　　TSS附近核小體定位具有重要的序列特征｡Arya等[6]報道了缺乏和含有 TATA盒的兩種啟動子核小體定位不同｡后者位于離TSS上游25~125 bp處,核小體缺失區域不明顯,這種啟動子可能被核小體完全占據,或者促進TSS下游核小體占據｡TSS和一些轉錄激活結合位點常被覆蓋｡酵母核小體缺失區域(NDR)兩側有2個強烈定位的核小體,+1核小體邊緣通常跨過TSS,可能參與調控轉錄的進行｡據統計,TSS上游基因間區核小體占據水平高于下游｡

　　TSS處核小體定位參與基因的轉錄調節過程｡劉宏德等[7]利用彎曲度譜法發現,核小體在編碼基因區域和miRNA基因啟動子區域定位有差異｡在TSS上游-200~-400 bp和-400~-600 bp處以及TSS下游約200 bp處核小體定位信號較強,在上游0~ -400 bp內存在核小體缺失區域,在這里轉錄因子結合位點分布較多,這可能與轉錄起始有關,有利于基因的轉錄,總之,除了序列因素,包括轉錄因子或者重塑酶,轉錄中的RNA聚合酶,核小體“統計定位”[8],Bdf1､SWR1復合物[9],和復制､轉錄等一些生物學過程與核小體定位也有密切關系｡其中,DNA 偏好性序列的生物物理性質對核小體定位起主要作用｡

　　1.2轉錄起始位點核小體定位與基因表達調控

　　基因轉錄水平與核小體缺乏程度有關[10]｡不僅如此,Ercan等[11]發現酵母基因組核小體密度與基因的轉錄效率之間呈負相關,轉錄因子與核小體相互作用能夠取代核小體,而核小體又會占據轉錄因子結合位點｡在TSS附近,核小體稀疏區域促成轉錄因子與靶位點結合而發揮作用｡然而,并非某一種因素單獨影響TSS附近核小體定位, 受到多種因素的共同作用｡可以通過染色質結構的改變,暴露出轉錄因子結合位點,影響基因的轉錄機制｡劉輝等[12]分析了人類CD4+T 細胞甲基化組蛋白ChIP-seq數據,發現甲基化修飾之后的核小體大多分布在基因啟動子處､TFBS區域｡有意思的是,核小體定位還能夠影響TSS處核苷酸多態性位點(SNPs)的分布,從而影響轉錄因子的結合[12-14],在TSS下游,核小體的規則分布與多態性位點的周期性具有一致性 [14],SNPs多位于核心DNA的兩端,而插入､插入刪除等多態性位點核小體缺乏｡Deniz等[15]統計分析了酵母的核小體定位數據集,發現核小體在啟動子區域內呈現周期性分布,周期性強度與基因轉錄水平呈負相關,與前面論述的觀點保持一致｡可能是組蛋白占據TFBS,通過負調控抑制基因轉錄｡

　　2轉錄起始位點核小體定位與序列依賴性因素

　　研究一致認為,DNA序列依賴性是轉錄起始位點核小體定位的主要因素,不同序列對組蛋白核心親和力不同[16],當然這主要發生在低等真核生物中｡然而,Gaffney等[17]通過研究人類12號染色體上的400多個核小體的排列,發現在大量連續重復序列中核小體定位在一些偏好性序列區域,核小體在核心DNA和連接DNA的偏好性也可通過k-mer頻次法進行統計[18,19]｡而這種偏好性在一定程度上依賴于A+T和G+C含量｡G/C二核苷酸在體外偏向于形成核小體,而非體內[20]｡李慧敏等[21]分析了調控酵母核糖體蛋白基因的主要轉錄因子在啟動子序列中的結合位點,發現A+T含量在 TSS附近較高,這樣便于DNA的解鏈和進行基因轉錄,A+T含量在內含子中也較高,常見的調控元件都富含堿基C和G｡充分地說明了核小體定位序列的特征｡

　　DNA序列有差異,核小體定位水平不同,引起基因表達調控不同｡TSS附近大多數TF位點距離很近,甚至部分重疊,與核小體存在競爭, 也在一定程度上表明轉錄起始位點附近核小體分布較少｡啟動子區域含有許多順式作用元件,比如內含子一定程度上引起轉錄調控機制的差異[21];某些基因的 TSS定位并預測,比如從GC偏好性等出發[22],有助于基因調控機制的探索｡然而,Dai等[23]認為核小體定位受基因組DNA序列和各種蛋白因子的共同作用｡

　　3轉錄起始位點核小體定位與表觀遺傳因素

　　既然核小體定位對于基因的轉錄調控､DNA復制等過程如此重要,因此, 本研究較詳細地總結了影響核小體定位的各種因素,除了序列因素,其他影響基因組上TSS處核小體位置的表觀遺傳因素,比如轉錄因子､DNA甲基化､組蛋白變體及修飾､染色質重塑､可變剪接等因素也在一定程度上影響核小體的動態定位[24],這幾種表觀遺傳因素與TSS處核小體的形成和定位有著密切關系,已成為目前表觀遺傳學領域研究較為熱點的問題｡

　　3.1TSS核小體定位與DNA甲基化

　　DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳因素, 與TSS附近核小體定位呈現特殊關系｡研究人員通過研究人類CD4+T細胞TFBS和TSS周圍核小體的分布情況,發現核小體動態地在定位､缺失之間改變｡TSS上下游200 bp內核小體定位,與DNA甲基化基本上呈正相關,在TFBS處呈互補模式｡DNA甲基化越高,越有利于核小體定位｡而且核小體核心DNA比連接DNA更易被甲基化,DNA甲基化位點與核小體定位也具有一致周期性｡除此之外,DNA甲基化會受組蛋白甲基化調節[25-27]｡關于核小體DNA甲基化,大部分研究并不認為DNA甲基化直接導致基因轉錄沉默發生[27],這可能與核小體定位機制有關,DNA甲基化同組蛋白甲基化共同調控基因表達,兩者之間關系密切｡比如組蛋白修飾H3K9甲基化能夠促進DNA甲基化的進程[28,29]｡Chodavarapu等[30]發現核小體和DNA甲基轉移酶關系保守,DNA甲基化酶傾向于修飾纏繞在組蛋白上的DNA,在外顯子中核小體高度富集,多定位于內含子與外顯子交界處｡DNA甲基化在外顯子的普遍存在,除了用于界定外顯子外,同時還與外顯子處核小體的偏好性存在保持一致｡

　　3.2TSS核小體定位與組蛋白變體､修飾

　　H2A.Z､ H3.3是組蛋白H2A的保守變體｡兩者通常在TSS附近參與形成核小體[31],對H2A.Z報道居多｡Bargaje等[32]報道H2A.Z缺失會改變釀酒酵母基因組轉錄水平,核小體定位在沉默基因和高表達基因中不同,前者核小體覆蓋TSS定位,而后者核小體則被取代｡位于TSS兩側的-1核小體和+1核小體的H2A.Z與基因表達的動態改變有關｡組蛋白變體能夠影響核小體的穩定性和足跡變化,這也說明了染色體構型受組蛋白變體等的影響｡核小體的去組裝和重新組裝需要組蛋白分子伴侶的介導[33],以及能影響激活轉錄所用關鍵因子的參與｡Tolstorukov等[34]認為人類含H2A.Z核小體偏好性地保護一段核心DNA序列免受微球菌核酸酶降解,這同樣說明H2A.Z可能會參與核小體和染色質結構的調整過程｡

　　然而,組蛋白變體的修飾也可影響核小體定位,進而影響基因轉錄活性調控｡在酵母H2A.Z的N末端多處乙酰化位點的突變,可能通過影響核小體結構,導致染色體傳遞受阻等｡有ChIP分析顯示,H2A.Z中K14的乙酰化修飾僅出現在轉錄活躍基因的啟動子上,在靜息基因啟動子區域幾乎沒有｡H2A.Z的部分生物學功能是由 H2A.Z和染色質復合物SWR1-C協同完成[35],染色質重塑復合物能夠影響H2A.Z的作用,兩者共同影響H2A.Z突變體細胞表型｡

　　H2A.Z在基因轉錄起始位點附近富含,與常染色質標記H3K4me3和H3K9ac的富含相一致,H2A.Z也與基因調控元件有關[36,37]｡ Zhang等[38]發現核小體可能存在于一些重要的功能區域,一些有活性的組蛋白變體H2A.Z在TSS上游占據較多,在下游不斷減少｡組蛋白修飾能夠控制順式調節元件中的染色質結構｡還有觀點認為,TSS附近H2A.Z是核因子Y(NF-Y)依賴性的,而且許多生物學過程中組蛋白乙酰化受核因子Y影響,可以用于甲基化與乙酰化的轉換､組蛋白變體募集等[39]｡在癌細胞中存在乙酰化H2A.Z,H2A.Z水平則減少｡TSS處H2A.Z乙酰化與抑癌基因沉默水平增加保持一致,與DNA甲基化呈負相關[40]｡因此,組蛋白翻譯后修飾對于轉錄起始位點處核小體定位水平以及基因的轉錄至關重要｡

　　3.3TSS核小體定位與染色質重塑

　　染色質結構及重塑復合物也與其他因素相互作用,共同影響核小體定位｡在不同啟動子區域,染色質結構一般會存在差別｡許多研究認為蛋白質復合物､染色質重塑因子ISWI家族成員[41]通過與ATPases作用,來迫使核小體在DNA上滑動或者交換,還有觀點認為,是DNA在核小體表面的扭曲度增加導致核小體的滑動[42,43]｡Varga-Weisz[44]認為依賴ATP的染色質重塑因子驅使核小體離開轉錄因子結合位點,阻止核小體進一步的結合｡染色質重塑因子可能和轉錄因子發生作用,影響基因的表達水平[45]｡不僅如此,滑動的核小體趨向于靠近啟動子區域,反映了轉錄起始位點處核小體的動態定位｡啟動子處核小體定位模型與轉錄依賴特性具有重要聯系,轉錄調節前后存在核小體去穩定性現象[46,47]｡

　　轉錄起始位點核小體定位受染色質重塑結構的影響,然而染色質的結構和功能受DNA修飾和組蛋白修飾的影響[48]｡Zlatanova等[49]認為染色質結構是高度動態的,生物大分子的裝配需要消耗ATP水解能來調節染色質結構｡染色質纖維拓撲樣結構､RNA聚合酶都能造成轉錄延伸中核小體結構高度不穩定,使聚合酶跨越核小體障礙,有利于轉錄的進行｡

　　3.4TSS核小體定位與RNA剪接

　　RNA剪接事件與核小體定位也有一定關系｡陳偉等[50]從人類基因組轉錄起始位點上下游選取探針序列,根據目的序列堿基特征,用多樣性增量二次判別方法(IDQD)構建模型,探討了在人類基因組剪接位點 (GT/AG)鄰近序列中的核小體分布,發現外顯子處DNA序列喜歡形成核小體,核小體較多,轉錄的RNA具有較強剛性,而剪接位點及其鄰近的內含子處則相反｡研究認為,DNA序列的核小體定位或者核小體缺失狀態與RNA的剛性/柔性具有統計相關性[50]｡Ringrose[51]也發現核小體定位和外顯子―內含子邊界顯著相關,研究也發現特定組蛋白修飾能夠調解選擇性剪接｡為了更好地預測TSS處核小體定位,有研究用支持向量機(SVM)等方法結合 TSS數據庫預測啟動子的位置[52]｡另有研究發現,存在大量因子影響核小體在DNA上的精確定位｡基因組序列中周期性的AA∶TT能夠維持核小體的穩定性｡TA二聚體常存在小溝,CG常存在大溝位置[53],可變剪接與核小體定位偏好性也有關系｡針對剪接事件發生的重要性,有課題組也開展了可變剪接的相關研究工作｡

　　3.5TSS核小體定位與RNA聚合酶II ､CpG島

　　RNA聚合酶是影響TSS處核小體定位反式因子中的重要因子｡RNA聚合酶影響核小體結構,核小體又會成為RNA聚合酶在DNA移動的轉錄屏障,RNA聚合酶為擺脫這一障礙,就需要逐出或者滑動核小體 [54],這種現象在啟動子和編碼區抵抗了核小體定位的熱動力學偏好性｡有研究認為,當啟動子TSS附近有核小體富集時,為激活轉錄RNA聚合酶Ⅱ提前進入TSS周圍｡然而,在核小體分布較少的TSS處,染色質結構開放能夠加速結合調節蛋白,進而可以募集RNA聚合酶用以轉錄[54]｡RNA聚合酶Ⅱ含量在外顯子中比在內含子多,核小體定位能夠調節RNA聚合酶Ⅱ的持續合成｡

　　不僅如此,已有研究發現,另一種因素CpG島偏好性地出現在基因的 TSS處,特別是在管家基因中｡在轉錄起始位點周圍核苷酸的周期性存在于含有CpG島的區域,在人類和黑猩猩相同基因組區域的序列也發現了同樣的現象｡在 TSS附近的SNP分布呈現周期性也與CpG島有關[55,56]｡在一些植物和真菌基因中的GC偏好性特征影響轉錄,這可能是由轉錄起始過程中基因突變或者有偏好性的轉錄因子結合位點造成的[57]｡Blackledge等[58]發現CpG島可以直接提供去甲基化酶,去除甲基化現象,CpG島與核小體定位有著重要的關系,但有待深入研究｡

　　4結語

　　本文從轉錄起始位點出發,較為詳細地概述了國內外核小體定位領域的最新研究進展,概括了核小體定位的多種影響因素,主要從序列依賴性和表觀遺傳因素兩方面進行了歸納和綜述,旨在把握現象并發現規律｡綜合大量研究發現,TSS周圍核小體定位特征具有一定的規律性,受DNA序列和表觀遺傳因素的共同作用,轉錄起始位點處核小體定位較少,除了序列特征造成的影響外,DNA甲基化的分布､組蛋白變體及組蛋白修飾､染色質重塑､可變剪接､RNA聚合酶Ⅱ等因素密切相關,從而調控基因表達水平｡對其深入研究具有重要的生物學意義,對于部分疾病的預防和治療具有重要價值｡對TSS核小體定位的各種特性進行精確的分析,能夠為相關研究領域提供參考｡目前對于這方面的研究大多是基于理論預測或者模型計算結果,而針對具體的基因功能位點核小體定位特性的試驗研究比較少,還需要理論設計與試驗驗證相結合,使得目前核小體定位的理論得到進一步完善｡

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