[摘要]鋅鐵調控轉運蛋白(ZRT， IRT-like protein， ZIP)在植物生長發育過程中起重要的調控作用。研究采用實時定量PCR(QPCR)和RACE技術，首次從珍稀瀕危蘭科藥用鐵皮石斛Dendrobium officinale中克隆得到1個ZIP基因cDNA全長，命名為DoZIP1，提交GenBank獲得注冊號KJ946203。生物信息學分析顯示，該基因開放閱讀框1 056 bp，編碼1條由351個氨基酸組成的肽鏈，相對分子質量37.57 kDa，等電點6.09。推定的DoZIP1蛋白具有保守的鋅鐵調控轉運相關蛋白結構域，二級結構包含α螺旋50.71%、延伸鏈11.11%、β轉角1.99%與隨機卷曲36.18%，具有信號肽和8個跨膜域，預測定位在質膜。該蛋白質氨基酸序列與擬南芥、苜蓿、水稻等物種ZIP蛋白相似性較高，系統進化分析表明其與AtZIP10，OsZIP3蛋白的親緣關系較近，聚在一個分支。QPCR分析表明，DoZIP1基因轉錄本在根中相對表達量較高，為莖中的4.19倍;葉次之，為莖的1.12倍。DoZIP1基因的分子特征為下一步研究其在鐵皮石斛生長發育過程的生物學功能奠定基礎。

　　[關鍵詞]農業科技論文投稿,鐵皮石斛,鋅鐵調控轉運蛋白,基因克隆,序列分析,實時定量PCR

　　Cloning and expression analysis of a zinc-regulated transporters (ZRT)，

　　iron-regulated transporter (IRT)-like protein encoding gene in

　　Dendrobium officinale

　　ZHANG Gang1，2， LI Yi-min1， LI Biao2， ZHANG Da-wei2， GUO Shun-xing2*

　　(1. College of Pharmacy and Shaanxi Provincial Key Laboratory for Chinese Medicine Basis & New Drugs

　　Research， Shaanxi University of Chinese Medicine， Xi′an 712046， China;

　　2. Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences-Peking Union

　　Medical College， Beijing 100193， China)

　　[Abstract]The zinc-regulated transporters (ZRT)， iron-regulated transporter (IRT)-like protein (ZIP) plays an important role in the growth and development of plant. In this study， a full length cDNA of ZIP encoding gene， designed as DoZIP1 (GenBank accession KJ946203)， was identified from Dendrobium officinale using RT-PCR and RACE. Bioinformatics analysis showed that DoZIP1 consisted of a 1 056 bp open reading frame (ORF) encoded a 351-aa protein with a molecular weight of 37.57 kDa and an isoelectric point (pI) of 6.09. The deduced DoZIP1 protein contained the conserved ZIP domain， and its secondary structure was composed of 50.71% alpha helix， 11.11% extended strand， 36.18% random coil， and beta turn 1.99%. DoZIP1 protein exhibited a signal peptide and eight transmembrane domains， presumably locating in cell membrane. The amino acid sequence had high homology with ZIP proteins from Arabidopsis， alfalfa and rice. A phylogenetic tree analysis demonstrated that DoZIP1 was closely related to AtZIP10 and OsZIP3， and they were clustered into one clade. Real time quantitative PCR analysis demonstrated that the transcription level of DoZIP1 in D. officinale roots was the highest (4.19 fold higher than that of stems)， followed by that of leaves (1.12 fold). Molecular characters of DoZIP1 will be useful for further functional determination of the gene involving in the growth and development of D. officinale. 　　[Key words]Dendrobium officinale; zinc-regulated transporters; iron-regulated transporter-like protein (ZIP); gene clone; sequence analysis; real time quantitative PCR

　　doi：10.4268/cjcmm20150108

　　鋅(Zn)是生物體中普遍存在的一種必需微量元素，對植物體的生長發育至關重要[1]。其作為300多種酶的輔因子不僅參與植物體的各種生理生化代謝途徑，而且在維系細胞膜穩定性和調控基因表達方面也起重要作用[1-2]。適當增加體內鋅含量可提高植物產量并改良品質，鋅缺乏則會導致植物細胞光和生理、蛋白合成以及質膜系統等功能異化，嚴重影響植物的生長發育[3]。因此，控制鋅離子在植物體內的生理平衡，對于維系植物體正常生理代謝是必須的。研究發現，許多膜轉運蛋白基因家族都涉及植物中鋅的吸收、轉運和體內平衡，其中，鋅鐵調控轉運蛋白[zinc-regulated transporters (ZRT)， iron-regulated transporter (IRT)-like protein， ZIP]是介導鋅轉運的一類重要蛋白[4]。現已從擬南芥[5]、苜蓿[6]、菜豆[7]、玉米[8]、大麥[9]和水稻[10]等植物中鑒定了大量ZIP基因家族成員。絕大多數ZIP蛋白含8個跨膜區及相似的膜拓撲結構，C-和N-末端位于膜外，位于胞內的“可變區”與Zn2+的結合、轉運密切相關[4]。除了轉運Zn2+，ZIP蛋白還負責胞內Fe2+，Mn2+，Cd2+等2價陽離子的轉運，同時，ZIP基因家族成員間表現出對不同離子的特異性和專一性[2，4]。可見，ZIP蛋白在維系植物細胞內部分金屬陽離子穩態方面起關鍵調控作用。

　　鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo為蘭科Orchidaceae石斛屬Dendrobium多年生草本植物，藥用部位為新鮮或干燥莖，具有益胃生津，滋陰清熱，潤肺止咳，明目強身等作用，是石斛屬藥用植物中最為珍稀名貴的種[11]。鐵皮石斛主要含多糖、生物堿、氨基酸、菲類化合物和微量元素等有效成分，具有重要的藥理活性[12]。鐵皮石斛已在生物學、藥理學等方面研究取得較大進展，但分子生物學研究相對匱乏[13-14]，限制了對其遺傳改良和資源開發。前期利用抑制性差減雜交(suppression subtractive hybridization，SSH)技術富集菌根真菌侵染鐵皮石斛根的差異表達基因[15]，分離到1條352 bp的EST，與水稻OsZIP8(GenBank注冊號BAJ25746)一致性較高(75%)，編碼一段ZIP蛋白羧基端肽鏈。鑒于ZIP基因在植物細胞生理代謝中的重要作用，本研究運用RACE技術克隆DoZIP1基因，并進行生物信息學和表達分析，為進一步揭示該基因在鐵皮石斛生長發育中的功能奠定基礎。

　　1材料與方法

　　1.1樣品野生鐵皮石斛D. officinale植物材料采自云南西雙版納，取石斛根、莖、葉組織樣品，液氮速凍后置-80 ℃保存備用。

　　1.2RNA提取和cDNA合成按照EASYspin植物RNA快速提取試劑盒(Aidlab， China)操作說明制備各樣品總RNA，NanoDropTM 2000分光光度計(Thermo Fisher， USA)分析RNA質量、純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。按照M-MLV Reverse Transcriptase Kit (Promega， USA)操作說明，逆轉錄合成cDNA第一鏈，-20 ℃保存備用。

　　1.3RACE與RT-PCR驗證根據原EST設計2對引物，按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit (Clotech， Japan)說明書進行巢式5′-RACE擴增。5′-RACE引物為：R1 5′-ACTATGCAGTAATTTAAGCCCATTTGGC-3′，R2-nest 5′-ATTTAAGCCCATTT GGCTAAAAG-3′(下劃線堿基反向互補為終止密碼子)。用2 μg總RNA合成5′-RACE ready cDNA，稀釋10倍，-20 ℃保存備用。

　　以R1與UPM組合，使用Program 1程序進行第一輪5′-RACE。反應體系：10× Advantage 2 PCR buffer 2.5 μL，dNTPs (10 mmol・L-1)0.5 μL，R1(10 μmol・L-1)0.5 μL，UPM (10 μmol・L-1) 0.5 μL，5′-RACE ready cDNA 1.0 μL，50 × Advatange 2 Polymerase Mix (5 U・L-1) 0.5 μL，補ddH2O至25 μL。各取1.0 μL反應產物作為模板，以R2-nest與Nested Universal Primer A (NUP)組合，進行第2輪5′-RACE。PCR程序為：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，32個循環;72 ℃ 7 min，4 ℃保溫。產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，TianGen膠回收試劑盒(TianGen， China)純化目的條帶，連接至pMD18-T vector (Takara， China)，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，隨機挑選3個克隆并送上海生工測序。 　　1.4生物信息學分析使用一系列網絡在線工具進行DoZIP1基因及編碼蛋白的生物信息學分析。利用NCBI的BLASTx(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)和ORF Finder(http：//www.ncbi.nlh.nih. gov/gorf/gorf.htmL)分析cDNA序列;用InterProScan(http：//www.ebi.ac.uk/cgi-bin/iprscan/)和PROSITE SCAN(http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/-npsa_ automat.pl?page=/NPSA/npsa_proscan.htmL)分析蛋白質結構域和基元;Protparam(http：//web.expasy.org/protparam/)和SOPMA(http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin /secpred_sopma.pl)分析蛋白質理化性質和二級結構;ProtScale(http：//web.expasy.org/protscale)分析蛋白的親水性/疏水性;SignalP 4.0 (http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測信號肽;TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測蛋白跨膜域。PSORT(http：//psort.ims.u-tokyo.ac.jp/ form. htmL)進行亞細胞定位分析。用DNASTAR 6.0，MEGA 4.0分別進行DoZIP1蛋白的氨基酸序列比對和進化樹構建分析。

　　1.5實時定量PCR分析分別用2 μg根、莖、葉樣品總RNA反轉錄合成cDNA，EF1a為內參基因[16]，qPCR分析DoZIP1基因的組織表達模式。引物為qPCR-F (5′-CGGGCTTCATCCACATACT CC-3′)和qPCR-R(5′-AACTATTCCCACCTCCAACACC-3′)的擴增產物長347 bp。用ABI PRISM 7500實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems， USA)進行擴增。反應體系25 μL包括2× SYBRR Premix Ex TaqTM Master Mix (Takara， China) 12.5 μL，正反向引物(10 μmol・L-1) 0.5 μL，ROX 0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 9 μL。每個反應重復3次，包括不加模板的對照，實驗重復3次。PCR程序為95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 45 s，40個循環，反應結束繪制溶解曲線。根據ABI PRISM 7500 SDS軟件(Applied Biosystems， USA)生成的循環閾值(Cycle threshold， CT)，用2-ΔΔCt法[17]計算相對表達量。

　　2結果與分析

　　2.1DoZIP1基因的克隆分析2次巢式5′-RACE擴增獲得長度約為1.1 kb的目標條帶(圖1)。因為R2-nest下游引物跨原EST的終止密碼子，該目標產物應該系基因全長�？寺�、測序和拼接分析獲得了一條1 100 bp的cDNA，BLASTx分析顯示其與GenBank已注冊的植物ZIP基因一致性為56%～64%。其包含的ORF長1 056 bp，5′-UTR長31 bp，3′-UTR長13 bp，起始密碼子附近序列AAAATGA符合KOZAK規則[18]，表明已成功獲得基因全長，命名為DoZIP1，提交GenBank獲得注冊號KJ946203。

　　1.5′RACE擴增產物; M .DL 2 000相對分子質量標準。

　　2.2DoZIP1蛋白的理化特性推定的DoZIP1蛋白含Leu最多，為47個(13.4%)，其次是Ala，Gly和Ile，均為33個(9.4%)，其他氨基酸數目在6.0%～0.9%，如Phe為20個(5.7%)，Thr為17個(4.8%)，Trp僅3個，占0.9%。Protparam預測其分子式為C1727H2732N436O468S15，含351個氨基酸，等電點(pI)6.09，相對分子質量37.57 kDa，正電殘基(Arg+Lys)21，負電殘基(Asp+Glu)27，不穩定系數36.13，脂肪系數高達119.77，親水性系數0.610。ProtScale分析結果顯示，DoZIP1蛋白疏水性最大值為3.456，親水性最高值為-3.211，且在較多位置上均表現出疏水性，說明其是1個疏水性蛋白質。

　　2.3DoZIP1蛋白的二級結構、結構域和保守基序分析SOPMA預測結果顯示(圖2)，DoZIP1蛋白二級結構共有α螺旋(alpha helix， 50.71%)178處，隨機卷曲(random coil， 36.18%)127處，延伸鏈(extended strand， 11.11%)39處以及β轉角(beta turn， 1.99%)7處;α螺旋和隨機卷曲為二級結構的主要元件，分散于整個蛋白質中。

　　InterProScan分析表明，DoZIP1蛋白含有鋅鐵調控轉運相關蛋白結構域(42～348)，以及1個典型的保守基序(HSVIIGLSLGA，209～219)。PROSITE SCAN分析表明DoZIP1蛋白含有數目不等的功能基元，包括2個N-糖基化位點(104～107，326～329)、3個蛋白激酶C磷酸化位點(42～44，225～227，287～289)、2個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(22～25，184～187)、8個N-肉豆蔻酰化位點(87～92，180～185，214～219，241～246，243～248，272～277，276～281，295～300)和1個酰胺化位點(34～37)，這些基元可能對蛋白的結構和功能具有重要的作用。 　　2.4DoZIP1蛋白亞細胞定位、信號肽和跨膜域預測PSORT預測DoZIP1蛋白定位在質膜的可能性最高為64%，定位于高爾基體幾率為46%，定位于內質網膜為37%，內質網腔為10%。SignalP4.1預測分析DoZIP1蛋白含1個信號肽(1～24)，為分泌蛋白。TMHMM分析結果顯示(圖3)，DoZIP1蛋白具有8個跨膜區(5～22，42～64，76～98，120～142，197～219，261～283，290～311，326～348)，位于第4，5個跨膜域間的可變區處于胞內，說明該基因編碼蛋白很可能為膜定位蛋白。

　　2.5DoZIP1和其他植物ZIP蛋白的多序列對比運用DNAStar 5.0中的MegAlign程序對DoZIP1蛋白和已知植物ZIP蛋白進行多序列對比分析。DoZIP1與葡萄(Vitis vinifera， XP_002264621)、柑橘(Citrus sinensis， XP_006481378)、毛果楊(Populus trichocarpa， XP_002307860)、蓖麻(Ricinus communis， XP_002527722)和水稻(Oryza sativa， Q7XLD4)等植物ZIP蛋白的一致性分別為61.8%，61.5%，61.3%，60.4%，50.1%(圖4)。

　　2.6DoZIP1與擬南芥、水稻ZIP家族蛋白的進化關系下載具有代表性的擬南芥Arabidopsis thaliana和水稻Oryza sativa ZIP家族蛋白氨基酸序列，使用MEGA 4.0 軟件鄰接法(Neighbour-joining， NJ)構建系統進化樹(圖5)。結果顯示，DoZIP1蛋白與ATIRT1，AtZIP8，OsZIP3，AtZIP10聚成一個分支，與OsZIP3，AtZIP10的親緣關系較近。

　　2.7基因表達模式分析分別提取鐵皮石斛根、莖、葉等樣品總RNA，利用實時定量基因擴增熒光檢測系統(QPCR)技術檢測基因表達模式。DoZIP1基因在3種組織中為組成型表達，相對表達量有明顯差異，轉錄本在根中相對表達量較高(圖6)，為莖中的4.19倍，葉中次之(1.12倍)。

　　3討論

　　鋅鐵調控轉運蛋白通過介導Zn2+，Fe2+，Mn2+，Cd2+等2價陽離子的轉運，調節胞內離子穩態，在植物生長發育過程中起重要調控作用。關于植物ZIP基因的系統性研究主要來自擬南芥[5]、苜蓿[6]、菜豆[7]、玉米[8]、大麥[9]和水稻[10]等重要模式植物或者作物，尚未見到藥用植物ZIP基因的相關報道。植物ZIP通常呈多基因家族，各成員之間協同作用控制著植物對微量元素的高效吸收和利用。鐵皮石斛生于海拔約1 600 m的山地半陰濕的巖石上，喜溫暖濕潤氣候和半陰半陽的特殊環境，生長緩慢，極難存活，野生資源瀕危[13]。鑒定鐵皮石斛ZIP家族基因并研究其生物學功能，揭示特殊生長環境下微量元素高效利用的生理機制，將為道地藥材形成的分子機制和高產優質品系的培育提供理論依據。因

　　此，本研究利用RACE技術分離到1個鐵皮石斛鋅鐵調控轉運蛋白編碼基因DoZIP1，并分析了編碼蛋白理化特性、結構域、跨膜域、亞細胞定位以及進化關系等生物信息學特征。

　　DoZIP1與多種植物ZIP基因一致性較高，編碼蛋白有ZIP家族的保守結構域和多個基序，其氨基酸數(351個)介于植物ZIP蛋白氨基酸數309～476[8]，可變區亦富含結合金屬離子的組氨酸殘基，這些符合植物ZIP的序列特征[4]。DoZIP1蛋白包含信號肽和跨膜域，系膜蛋白，印證了PSORT的質膜定位分析，和其他植物ZIP蛋白的膜定位特性一致[2，4]。同一基因家族的不同成員一般包含相似序列和功能結構域，執行類似的生物學功能[19]。DoZIP1與OsZIP3，AtZIP10處于ZIP系統進化樹的同一分支上、親緣關系較近，OsZIP3受缺鋅條件誘導參與水稻對鋅的吸收[10]，DoZIP1蛋白應該具有相類似的作用。植物對礦質元素的吸收主要在根中進行，細胞利用離子通道、轉運子等蛋白通過質外體或共質體策略介導礦質元素的吸收、轉運和分配，調控植物的生理適應和生長發育[6]。實時定量PCR分析結果顯示DoZIP1基因在石斛根中表達豐度較高，因此推測該基因可能在石斛根中發揮轉運微量元素的生理作用。當然，DoZIP1基因究竟在微量元素轉運過程的怎樣起作用，石斛ZIP基因家族其他成員與其功能有何差異，是否存在相互作用，這些有待于進一步深入研究。

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