葡萄糖淀粉酶（E.C3.2.1.3）從淀粉的非還原端水解α-1，4糖苷鍵產(chǎn)生β-D-葡萄糖，由于葡萄糖淀粉酶對(duì)淀粉的水解以葡萄糖為惟一產(chǎn)物[1]，因此葡萄糖淀粉酶在以葡萄糖為原料的一些生物行業(yè)有廣泛應(yīng)用，特別是在食品、醫(yī)藥、發(fā)酵等領(lǐng)域[2，3]。

　　摘要：對(duì)串珠鐮刀菌（Fusariummoniliforme）和禾谷鐮刀菌（F.graminearum）所產(chǎn)葡萄糖淀粉酶部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明這2種鐮刀菌產(chǎn)的葡萄糖淀粉酶的性質(zhì)較為相似。50～60℃酶活性較高，最高酶活性出現(xiàn)在50℃，串珠鐮刀菌比禾谷鐮刀菌所產(chǎn)生的酶熱穩(wěn)定性稍高。pH5.0～6.0之間酶活性較高，pH5.0～8.0之間穩(wěn)定。金屬離子Mn2+、Cu2+對(duì)2種鐮刀菌產(chǎn)酶的酶活性有較強(qiáng)的激活作用，其中Mn2+激活作用最強(qiáng)烈，Mn2+作用后禾谷鐮刀菌和串珠鐮刀菌葡萄糖淀粉酶的活性分別為對(duì)照的176%和173%。金屬離子Na+、Ca2+及Fe2+則會(huì)抑制這2種鐮刀菌產(chǎn)葡萄糖淀粉酶的活性。

　　關(guān)鍵詞：串珠鐮刀菌（Fusariummoniliforme）,禾谷鐮刀菌（F.graminearum）,葡萄糖淀粉酶,酶學(xué)性質(zhì)

　　工業(yè)上應(yīng)用的葡萄糖淀粉酶主要來(lái)自于曲霉屬（Aspergillus）及根霉屬（Rhizopus）[4-10]，鐮刀菌屬（Fusarium）的葡萄糖淀粉酶報(bào)道較少。曲霉屬及根霉屬菌株葡萄糖淀粉酶及其酶學(xué)性質(zhì)的研究較多[6-10]，鐮刀菌屬的葡萄糖淀粉酶，如半裸鐮刀菌（F.pallidoroseum）[11]、尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）[11]、茄腐皮鐮刀菌（F.solani）[12]、蔗草鐮刀菌（F.scirpi）[12]等也有報(bào)道，不同來(lái)源的酶性質(zhì)存在很大差異。這些絲狀真菌能夠?qū)⒑铣傻拿傅鞍追置诘桨�外，便于酶的提取純化。不同�?lái)源的葡萄糖淀粉酶性質(zhì)不同，在耐熱性、pH穩(wěn)定性以及催化活性上都存在差別，而不同的生物加工過(guò)程需要不同性質(zhì)的酶，因此對(duì)新型的葡萄糖淀粉酶進(jìn)行篩選并開(kāi)展性質(zhì)研究顯得特別重要。

　　前期對(duì)幾十株真菌進(jìn)行了淀粉降解酶的篩選工作，從中得到產(chǎn)酶活性較高的一株串珠鐮刀菌（Fusariummoniliforme）以及一株禾谷鐮刀菌（Fusariumgraminearum），本研究對(duì)其中的部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。

　　1材料與方法

　　1.1材料

　　串珠鐮刀菌以及禾谷鐮刀菌由山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選并保存。生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

　　1.2方法

　　1.2.1固態(tài)發(fā)酵250mL三角瓶中裝麥麩5g，加水5mL，121℃蒸汽滅菌。用7mm打孔器從長(zhǎng)滿菌絲的PDA平板上打出3個(gè)菌斑接種至三角瓶，28℃靜置培養(yǎng)。分別于72h以及96h搖動(dòng)一次，120h時(shí)測(cè)定酶活性。發(fā)酵結(jié)束后固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中加滅菌蒸餾水100mL，搗碎，28℃搖床振蕩浸提1h，4℃、6000r/min離心10min，上清液為粗酶液。

　　1.2.2硫酸銨沉淀蛋白向葡萄糖淀粉酶粗酶液中加入硫酸銨，不斷地緩慢攪拌，直至硫酸銨濃度達(dá)到80%飽和度，置于4℃冰箱過(guò)夜；10000r/min離心15min，棄上清，將沉淀蛋白用蒸餾水溶解，透析后用于測(cè)定粗酶的酶學(xué)性質(zhì)。

　　1.2.3酶活測(cè)定[13]底物為用0.1mol/LpH6.0磷酸鹽緩沖液體配制的1%可溶性淀粉溶液。25mL刻度試管中加底物0.9mL，在測(cè)定溫度下預(yù)熱10min，加0.1mL適當(dāng)稀釋的粗酶液準(zhǔn)確反應(yīng)5min，加2mLDNS溶液，煮沸5min，流水冷卻，稀釋至25mL，540nm測(cè)定吸光值。1h釋放1mg還原糖（以葡萄糖計(jì)）的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U）。

　　1.2.4最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性[14]于不同溫度下測(cè)定酶活，最高酶活定為100%，其余酶活與之相比計(jì)算相對(duì)酶活，尋找酶的最適反應(yīng)溫度。取適量酶液不同溫度下保溫，保溫結(jié)束立即置于冰水中冷卻，測(cè)定殘余酶活，研究酶的熱穩(wěn)定性，以不經(jīng)熱處理的酶活為100%。

　　1.2.5最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性分別用不同pH的磷酸緩沖液配制可溶性淀粉溶液，測(cè)定酶活，最高酶活定為100%，其余酶活與之相比計(jì)算相對(duì)酶活，尋找最適反應(yīng)pH。取適量酶液分別在不同pH緩沖液中30℃保溫6h，測(cè)定殘余酶活，研究酶的pH穩(wěn)定性；以未處理的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。

　　1.2.6金屬離子對(duì)酶活力的影響[14]在反應(yīng)體系中分別加入（鹽酸鹽或硫酸鹽）Cu2+、K+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+、Na+，使其終濃度為2mmol/L，室溫下靜置30min，測(cè)定酶活；以不加金屬離子的空白對(duì)照酶活為100%。

　　1.2.7酶解產(chǎn)物的薄層層析[15]在0.5mL1%可溶性淀粉中加入適當(dāng)稀釋的硫酸銨沉淀的酶液0.1mL，30℃反應(yīng)1h，然后在硅膠板上進(jìn)行薄層層析，展開(kāi)液為丁醇∶乙醇∶水=5∶3∶2，碘缸內(nèi)染色24h。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1酶活性

　　對(duì)2種鐮刀菌進(jìn)行固體培養(yǎng)并測(cè)定酶活性，以實(shí)驗(yàn)室保存的一株黑曲霉為對(duì)照，結(jié)果如圖1所示。黑曲霉葡萄糖淀粉酶酶活為1206U/g，串珠鐮刀菌和禾谷鐮刀菌分別為783U/g以及1065U/g，比黑曲霉低。

　　2.2淀粉酶對(duì)淀粉的酶解產(chǎn)物分析

　　對(duì)硫酸銨沉淀后的粗酶酶解可溶性淀粉的產(chǎn)物進(jìn)行薄層層析，結(jié)果表明，葡萄糖是惟一可見(jiàn)的酶解產(chǎn)物（圖2），此作用方式為典型的葡萄糖淀粉酶的作用方式，因此串珠鐮刀菌和禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的淀粉分解酶主要為葡萄糖淀粉酶。2.3葡萄糖淀粉酶的最適反應(yīng)溫度

　　不同溫度下測(cè)定2種鐮刀菌所產(chǎn)葡萄糖淀粉酶的活性（圖3），結(jié)果顯示此酶在50～60℃范圍內(nèi)酶活性最高，30～50℃有70%以上的活性，溫度達(dá)到60℃時(shí)以上酶活性降低。

　　2.4葡萄糖淀粉酶的熱穩(wěn)定性

　　串珠鐮刀菌產(chǎn)生的葡糖淀粉酶在40℃以下很穩(wěn)定（圖4），40℃保溫90min酶活性基本沒(méi)有損失；50℃保溫酶活損失很快，保溫90min損失70%以上；60℃條件下酶活迅速喪失，保溫10min酶活性已經(jīng)損失90%以上，表明此酶的熱穩(wěn)定性較差。

　　禾谷鐮刀菌所產(chǎn)葡萄糖淀粉酶與串珠鐮刀菌所產(chǎn)酶的熱穩(wěn)定性基本一致（圖5），可能是由于兩株菌進(jìn)化關(guān)系較近，所產(chǎn)酶的結(jié)構(gòu)也可能較為類似，因此導(dǎo)致其熱穩(wěn)定性基本一致。

　　2.5酶的最適反應(yīng)pH

　　對(duì)葡萄糖淀粉酶的最適反應(yīng)pH研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖6），串珠鐮刀菌和禾谷鐮刀菌葡萄糖淀粉酶最高酶活出現(xiàn)在pH5.0附近，微酸性環(huán)境中酶活性較高，pH小于4.0時(shí)酶活性迅速下降。

　　2.6葡萄糖淀粉酶的pH穩(wěn)定性

　　研究了2種鐮刀菌葡萄糖淀粉酶的pH穩(wěn)定性（圖7），結(jié)果表明，2種酶在pH5.0～7.0之間穩(wěn)定性較好，pH5.0～7.0之間30℃放置6h酶活性保持90%以上，pH4.0以下酶活性喪失較快。

　　2.7不同金屬離子對(duì)2種鐮刀菌葡萄糖淀粉酶活性的影響

　　研究了不同金屬離子對(duì)葡萄糖淀粉酶活性的影響（圖8），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Mn2+、Cu2+對(duì)2種鐮刀菌葡萄糖淀粉酶活性都有較強(qiáng)的激活作用，其中Mn2+激活作用最強(qiáng)烈，Mn2+作用后禾谷鐮刀菌和串珠鐮刀菌葡萄糖淀粉酶的活性分別為對(duì)照的176%和173%。Na+、Ca2+、Fe2+對(duì)酶活性有抑制作用；而K+、Mg2+、Zn2+對(duì)酶活性有輕微激活作用。

　　3討論

　　有關(guān)曲霉屬及根霉屬菌株葡萄糖淀粉酶及其酶學(xué)性質(zhì)的研究較多[6-10]，鐮刀菌屬的半裸鐮刀菌[11]、尖孢鐮刀菌[11]、茄腐皮鐮刀菌[12]、蔗草鐮刀菌[12]、串珠鐮刀菌[16，17]等產(chǎn)葡萄糖淀粉酶也有報(bào)道，不同來(lái)源的酶性質(zhì)存在很大差異。

　　茄腐皮鐮刀菌[12]產(chǎn)的葡萄糖淀粉酶在50℃時(shí)穩(wěn)定，50℃保溫60min酶活性仍保留79%；Tochukwu等[14]篩選的一株鐮刀菌所產(chǎn)葡萄糖淀粉酶在40～70℃之間酶活性都比較高，最高酶活出現(xiàn)在50℃，而且熱穩(wěn)定性非常高，70℃保存30min酶活性仍保留78%；尖孢鐮刀菌和蔗草鐮刀菌[9]的最適反應(yīng)溫度分別為30℃和40℃。本試驗(yàn)中2種鐮刀菌在50℃時(shí)有最高酶活性，50～60℃之間酶活性較高；然而熱穩(wěn)定性較差，50℃保溫1h酶活力剩余不到50%，其最適反應(yīng)溫度以及熱穩(wěn)定性與報(bào)道的曲霉菌及鏈霉菌屬中葡萄糖淀粉酶的性質(zhì)較為相近[7，8]。

　　真菌葡萄糖淀粉酶的最適反應(yīng)pH多為酸性，而且一般在酸性及中性pH時(shí)穩(wěn)定[8，12，14]。茄腐皮鐮刀菌[12]在pH3.0～5.0有較高的酶活性；尖孢鐮刀菌和蔗草鐮刀菌[18]分泌淀粉酶的最適反應(yīng)pH為6.9；Tochukwu等[14]篩選的鐮刀菌在pH6.5～8.5有較高的酶活性，pH4.5～7.0穩(wěn)定。而本試驗(yàn)結(jié)果表明，禾谷鐮刀菌和串珠鐮刀菌在弱酸性條件下酶活性較高，最高酶活性出現(xiàn)在pH5.0～6.0。在本研究pH5.0～7.0條件下酶活性都保留90%以上，pH4.0以下處理酶活性喪失很快。

　　大部分淀粉酶的活性都需要有金屬離子的參與，特別是二價(jià)金屬離子對(duì)淀粉酶的活性有激活作用。文獻(xiàn)報(bào)道真菌葡糖淀粉酶一般被Cu2+、Mg2+、Zn2+、Ca2+等不同程度地激活[9，10，12]，但不同金屬離子對(duì)不同來(lái)源的酶的作用有所差異[5]。茄腐皮鐮刀菌[12]葡萄糖淀粉酶酶活性被Cu2+、Mg2+激活，被Hg2+、Pb2+、Zn2+、Ni2+以及Fe3+抑制；Tochukwu等[14]篩選的菌株所產(chǎn)酶被Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+等激活，被Mn2+以及Fe2+抑制。本試驗(yàn)中，Mn2+、Cu2+對(duì)2種鐮刀菌都有較強(qiáng)的激活作用，其中Mn2+激活作用最為強(qiáng)烈，Na+、Ca2+、Fe2+對(duì)酶活性有抑制作用。

　　可見(jiàn)，不同來(lái)源的菌株所產(chǎn)的葡萄糖淀粉酶性質(zhì)不同，通過(guò)對(duì)不同菌株的篩選研究發(fā)掘不同性質(zhì)的酶可以應(yīng)用于不同的行業(yè)。本試驗(yàn)對(duì)禾谷鐮刀菌以及串珠鐮刀菌所產(chǎn)生的葡萄糖淀粉酶的部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，以期對(duì)這2種菌葡萄糖淀粉酶的開(kāi)發(fā)利用提供一定的借鑒作用。

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