隨著化石燃料的日益枯竭，現代社會依靠化石燃料的現狀遭到了嚴重的挑戰[1]。依照人類對化石燃料的消耗速率和現已探明的地球化石燃料儲量，化石燃料可能在未來50年消耗殆盡。因此，探尋可再生能源已迫在眉睫。生物柴油被認為是最有望代替化石燃料的可再生能源[2，3]。由于傳統的植物油和動物脂肪的短缺，不能滿足生物柴油生產的原料供給[4]，微藻以其高生長速率、高油脂產率和生長空間廣闊等優勢被認為是最具潛力的生物柴油原料[5]。然而在微藻自養培養生產生物柴油的過程中也遇到了瓶頸問題。微藻在光合自養（Photoautotrophy）條件下生長速度緩慢，藻液濃度低，增加了微藻采收的成本[6]，使微藻制生物柴油用于商業生產的經濟可行性很低[7]。解決這一問題的方法之一是在自養培養基中添加外加碳源，使微藻利用外加碳源進行異養（Heterotrophy）或兼養（Mixotrophy）生長。

　　摘要：篩選小球藻（Chlorellasp.）的適宜碳源，比較研究小球藻在不同營養方式下的生長情況。結果表明，葡萄糖能顯著促進小球藻生長，且小球藻可利用葡萄糖在化能異養、光激活異養、光異養及兼養條件下均可生長，其比生長速率從大到小依次為：兼養、光異養、光激活異養、化能異養及光合自養。兼養培養比生長速率接近于光合自養和光異養培養下的比生長速率之和。

　　關鍵詞：小球藻（Chlorellasp.）,微藻,適宜碳源,異養,兼養

　　與高等植物相比，微藻不僅可以利用光能和CO2進行光合自養生長，而且可以利用外加碳源進行異養和兼養生長。光合自養的光抑制性是限制微藻生物量增加的主要原因，異養培養以外加碳為碳源和能源[8]，能夠降低光合自養培養的不足。Zheng等[9]通過異養培養Chlorellasorokiniana所得微藻細胞濃度是自養培養的3.3倍。異養培養和兼養培養不僅能提高微藻的生物量，還可以改變其油脂含量[10]，繆曉玲等[11]通過異養轉化細胞工程技術獲得了油脂含量高達57.9%的異養小球藻，使油脂含量在光合自養的基礎上提高了4倍。

　　小球藻（Chlorellasp.）為綠藻門小球藻屬普生性單細胞綠藻，是一種球形單細胞淡水微藻。目前，用于產油制生物柴油的小球藻主要有原始小球藻（Chlorellaprotothecoides）和普通小球藻（Chlorellavulgaris）等，關于小球藻培養的研究報道主要集中在自養培養和異養培養方面[12-14]，但對小球藻的自養、化能異養（Chemoheterotrophy）、光激活異養（Light-activatedheterotrophicgrowth，LAHG）、光異養（Photoheterotrophy）和兼養培養的系統比較研究報道較少。本研究對小球藻適宜碳源和其營養方式進行了比較試驗，以期得到高密度培養小球藻的適宜培養方式，為微藻煉制生物質燃料以及充分利用這一資源的其他領域提供相關數據。

　　1材料與方法

　　1.1藻種

　　小球藻購自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫。

　　1.2培養基與試劑

　　SE基礎培養液（1L）：NaNO3250mg，K2HPO475mg，MgSO4·7H2O75mg，CaCl2·2H2O25mg，KH2PO4175mg，NaCl25mg，FeCl3·6H2O5mg，EDTA-Fe1mL，Tracementalsolution1mL，土壤提取液40mL，蒸餾水958mL。

　　試劑：葡萄糖，丙酮酸鈉，乙酸鈉，碳酸氫鈉，碳酸鈉，3-（3，4-二氯苯基）-1，1-二甲脲（DCMU，購于Sigma公司），頭孢噻肟鈉。

　　1.3培養條件

　　將配制分裝好的培養基在高壓滅菌鍋中121℃滅菌20min，滅菌后冷卻至室溫，添加頭孢噻肟鈉至0.5g/L防止染菌。在超凈臺中將生長至對數期的微藻接種于含150mL培養基的250mL錐形瓶中（接種量20%V/V）于溫度30℃、平均光照度5000lx的培養箱中培養，光暗比12h∶12h。

　　1.4試驗設計

　　1.4.1小球藻適宜碳源選擇選取葡萄糖、丙酮酸鈉、乙酸鈉、碳酸氫鈉和碳酸鈉作為小球藻的外加碳源，外加碳源濃度為0.1g/L（按碳含量計，本試驗所添加的碳源濃度均以碳含量計。下同），每組設3個平行試驗，進行兼養培養。每隔24h測定其生物量。

　　1.4.2小球藻培養方式選擇光合自養培養：將微藻接種于SE基礎培養基中，在光照條件下培養。設置3個平行試驗，每隔24h測定其生物量。

　　兼養培養：在SE培養基中添加碳濃度0.2g/L的葡萄糖，于光照條件下培養。設置3個平行試驗，每隔24h測定其生物量。

　　化能異養：在SE培養基中添加碳濃度0.2g/L的葡萄糖，將錐形瓶用黑色布袋包裹，于完全黑暗條件下培養。設置3個平行試驗，每隔24h測定其生物量。

　　光激活異養：在SE培養基中添加碳濃度0.2g/L的葡萄糖，將錐形瓶用黑色布袋包裹，于完全黑暗條件下培養，每24h取下布袋，以5000lx脈沖式短波照射10min。設置3個平行試驗，每隔24h測定其生物量。

　　光異養：在SE培養基中添加碳濃度0.2g/L的葡萄糖，并添加10-6mol/L3-（3，4-二氯苯基）-1，1-二甲脲（DCMU），于光照條件下培養。設置3個平行試驗，每隔24h測定其生物量。

　　1.5分析方法

　　式中μ為比生長速率（d-1），N1和N0分別為T1時刻和T0時刻時小球藻的細胞密度。微藻干重測定：培養至10d后，取100mL藻液于8000r/min離心5min，用蒸餾水洗2次，置于已恒重的稱量瓶中，105℃下烘干至恒重，用分析天平稱量，所得質量減去稱量瓶質量為小球藻細胞干重。

　　2結果與討論

　　2.1小球藻適宜碳源選擇

　　碳源是微藻異養、兼養生長最關鍵的影響因素，選擇合適的碳源對微藻異養、兼養生長的生物量產量和產物組成起到極為關鍵的作用。不同的微藻對碳源的需求不同，一些微藻既能利用有機碳又能利用無機碳進行兼養生長，同時進行呼吸過程和光合作用[16]。本研究以3種有機碳和2種無機碳為碳源，對小球藻生物量的影響見圖1，對小球藻比生長速率的影響見圖2。從圖1可以看出：小球藻均能利用葡萄糖、丙酮酸鈉、乙酸鈉、碳酸氫鈉和碳酸鈉進行生長，添加碳源的試驗組生長狀況均顯著優于未添加碳源的對照組，其生物量分別是自養生長的3.1、2.7、1.6、2.0、1.5倍。從圖2可以看出：添加碳源的試驗組比生長速率分別是自養生長的2.5、2.4、1.6、2.0、1.7倍。其中，葡萄糖對小球藻生長的促進作用最為明顯，最終生物量和比生長速率分別是對照組的3.1和2.5倍。其原因可能與相同物質量的碳源所含能量不同有關，如葡萄糖在代謝中能產生大約2.8kJ/mol的熱量。

　　2.2小球藻適宜培養方式

　　大量研究表明，許多微藻有利用外加碳源進行兼養和異養生長的能力。如魚腥藻（Anabeana）HB1017株能利用果糖、葡萄糖、蔗糖為底物進行化能異養生長[17，18]。集胞藻（Synechocystissp.）PCC6803可以在每天短時光照（5min）條件下利用葡萄糖進行光激活異養[19，20]，三角褐指藻（PheaodactylumtricornutumBohlin）具有兼養生長的能力[21]。

　　本試驗對小球藻自養、兼養和異養進行比較研究，結果如圖3和圖4所示。小球藻能利用葡萄糖進行化能異養、光激活異養、光異養和兼養生長。在化能異養和光激活異養條件下，小球藻顏色依然為綠色，但生長緩慢。在添加DCMU的光異養條件下，小球藻生長狀況優于化能異養和光激活異養，但培養12d以后因葡萄糖耗盡而死亡。由于DCMU是光合作用抑制劑，在培養基中加入DCMU后，微藻細胞光系統Ⅱ的活性被抑制，阻斷了非環式電子傳遞，NADPH產生受阻，CO2不能被微藻同化吸收[22-24]。所以當葡萄糖被耗盡時，如不再添加碳源，微藻細胞由于缺少生長所必需的碳源而死亡。在本試驗培養條件中，小球藻在兼養條件下的生長狀況最好，兼養培養兼有光合自養與異養代謝的性質，大多數微藻兼養的比生長速率等于異養培養與自養培養比生長速率之和（μ兼養=μ異養+μ自養）。在光合自養條件下，CO2作為惟一碳源維持微藻生長，而在光異養條件下，非環式電子傳遞被阻斷，CO2不能被同化吸收，微藻只能利用有機碳進行生長，由圖4可知，小球藻光合自養比生長速率（0.13）和光異養比生長速率（0.19）之和（0.32）非常接近于兼養比生長速率（0.33），基本可以認定小球藻兼養培養比生長速率等于光異養培養與自養培養比生長速率之和（μ兼養=μ異養+μ自養）。培養10d后，所得生物量產率如表1所示，小球藻化能異養、光激活異養、光異養和兼養生長的生物量產率分別是自養生長的1.3、1.5、2.2、5.9倍。由此可知，兼養培養是獲得小球藻高密度、高產量、短周期培養的最佳營養方式。

　　3結論

　　小球藻能利用多種外加碳源進行異養兼養生長，在本試驗所選的3種有機碳和2種無機碳源中，葡萄糖促進其生長的效果最為明顯。

　　小球藻比生長速率從大到小依次為：兼養、光異養、光激活異養、化能異養及光合自養，其中兼養的比生長速率等于光合自養培養與光異養培養比生長速率之和。小球藻化能異養、光激活異養、光異養和兼養生長的生物量產率分別是自養生長的1.3、1.5、2.2、5.9倍。兼養培養是獲得小球藻高密度、高產量、短周期培養的最佳營養方式。

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