摘要:通過研磨法和涂布平板法對山藥(Dioscorea batatas Decne)不同部位的內生菌進行分離,共獲得34株菌株,并對這些菌株作拮抗性篩選和生物學特性分析。結果表明,有4株菌株對枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)具有明顯的抑菌效果,抑制率均在24%以上,其中菌株HNSQSY04的抑制率最大,達52%;有1株菌株對大腸桿菌 (Escherichia coli)有抑菌效果。對篩選出的4株菌株做了革蘭氏染色和芽孢染色、菌體大小和生長曲線等特性分析,表明HNSQSY04的特征符合芽孢桿菌屬,HNSQSY14、HNSQSY24和 HNSQSY31均有桿菌的特征。

　　關鍵詞:農業期刊論文投稿格式,山藥(Dioscorea batatas Decne),內生菌,抑菌活性,分離,篩選

　　Isolation and Screening of Endophytes with Inhibition Activity

　　from Chinese Yam Rhizomes

　　ZHAO Long-fei

　　(College of Life Sciences, Shangqiu Normal University, Shangqiu 476000, China)

　　Abstract: A total of 34 endophytes were isolated from different parts of Chinese yam rhizomes by grinding method and spread plate method. Inhibition activity against pathogens and its biological characteristics were analyzed. The results showed that four strains preliminarily screened had obvious inhibition to Bacillus subtilis, with inhibition rates of above 24%. Strain HNSQSY04 had the maximum inhibition rate of 52%. One strain had inhibition activity to Escherichia coli. Gram staining, spore staining, growth curve of four strains screened were analyzed. Results showed that HNSQSY14, HNSQSY24, and HNSQSY31 had Bacillus genus features. HNSQSY04 had the features of the genus Gracilibacillus.

　　Key words: yam rhizome; endophyte; inhibition activity; isolation; screening

　　植物內生菌(Endophyte)是指一類在其部分或全部生活史中存活于健康植物各種組織內部或細胞間隙，而不使宿主產生明顯病理癥狀的微生物[1]。植物是內生菌的宿主并給內生菌提供營養，內生菌則產生具有一定生物活性的次生代謝產物，如植物生長調節劑、抑菌劑、殺蟲物質、抗病毒成分等[2]，與植物形成共生互利關系，產生一定的生物防治和穩定生態環境的作用[3]。將植物內生菌作為生物防治菌不僅可避免因使用化學農藥給環境帶來的污染，還可避免殺死非靶標微生物和破壞植物根際土壤的微生態平衡，在防治植物病害方面有較大的應用潛力，成為國內外微生物研究的熱點之一[3-5]。

　　山藥(Dioscorea batatas Decne)為薯蕷科(Dioscoreaceae)薯蕷屬(Dioscorea)多年生草質藤本植物薯蕷的塊根，是中國傳統的藥食同源植物。它含有豐富的DHEA、蛋白質、糖類、黏液質、皂苷、維生素、膽堿、淀粉酶、糖蛋白、氨基酸、多酚氧化酶等成分。一些研究對山藥的內生細菌和真菌進行了分離和篩選[2，6-8]，但鮮見對河南山藥病原菌拮抗性內生菌系統研究的報道。本研究以河南山藥為試驗材料，篩選對細菌具拮抗作用的內生菌，并進行微生物學鑒定，以獲取其基本信息，為山藥拮抗菌的利用提供理論依據。

　　1材料與方法

　　1.1材料

　　1.1.1山藥惠樓山藥,來自于河南省商丘市虞城惠店集鄉樓村(砂壤土);鐵棍山藥,來自河南省焦作市溫縣(黏土)。

　　1.1.2試劑草酸銨結晶紫、盧戈氏碘液、番紅、次氯酸鈉、無水乙醇、孔雀石綠等。

　　1.1.3培養基 LB固體培養基:NaCl 10 g,酵母膏5 g,蛋白胨10 g,瓊脂10 g,補水至1 000 mL,pH 7.2~7.4,121 ℃滅菌 20 min [9]。液體培養基不加瓊脂。

　　牛肉膏蛋白胨液體培養基:牛肉膏3.0 g,蛋白胨10.0 g,NaCl 5.0 g,補水至1 000 mL,pH 7.2~7.4,121 ℃滅菌20 min[9]。固體培養基另加瓊脂10 g。

　　高氏1號培養基:可溶性淀粉20 g,KNO3 1.0 g,NaCl 0.5 g,K2HPO4・3H2O 0.5 g, MgSO4・7H2O 0.5 g,FeSO4・7H2O 0.01 g,瓊脂20 g,補水至1 000 mL,pH 7.4~7.6,121 ℃滅菌30 min[9]。

　　1.2方法

　　1.2.1材料的表面消毒分別取山藥的底部、中部、上部,先用無菌水沖洗2~3次;把山藥放入75%乙醇中30 s,迅速取出再放入5%的次氯酸鈉中3~8 min,然后用無菌水沖洗5~8次。最后一次沖洗過各部位的水用移液槍分別吸取500 μL涂平板,檢測表面消毒是否徹底。

　　1.2.2內生菌的分離、純化和保藏經表面消毒的山藥組織2 g放入無菌研缽中,研磨至黏稠漿狀[6],向研缽中加入18 mL無菌水,攪拌均勻,即制成10-1的菌懸液。取不同部位的山藥研磨液,分別稀釋成10-2、10-3、10-4 3個梯度。分別取山藥不同部位研磨液的稀釋液500 μL涂布平板,3個重復。置入恒溫恒濕培養箱中30 ℃倒置培養,觀察、記錄結果。挑取單菌落,以劃線分離法接種到培養基上28 ℃倒置培養24 h后鏡檢觀察。重復操作,直至獲得純菌株。

　　1.2.3拮抗菌的篩選和鑒定

　　1)病原菌的活化。大腸桿菌(Escherichia coli CGMCC1.1103)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis CGMCC1.769),為商丘師范學院生命科學學院微生物學教研室保藏。

　　將大腸桿菌和枯草芽孢桿菌以平板劃線法轉接到牛肉膏蛋白胨培養基上,置于培養箱中28 ℃倒置培養,活化后分別轉接到牛肉膏蛋白胨斜面上,待斜面長飽滿后暫時保藏于4 ℃冰箱備用。

　　2)拮抗菌篩選。采用濾紙片法[10]篩選對病原菌有抑制作用的內生菌。制備大腸桿菌菌懸液,用移液槍吸取200 μL涂布牛肉膏蛋白胨平板。在平板上均勻放置4個直徑1.00 cm的圓形濾紙片,在濾紙片上加10 μL內生菌懸液,以滴加10 μL無菌水的作為空白對照,30 ℃恒溫倒置培養。枯草芽孢桿菌的操作方法同大腸桿菌。觀察并記錄試驗結果,選取具有抑菌效果的菌株復篩。復篩以相同方法進行,培養72 h后測抑菌圈直徑(含濾紙片),每株菌3個重復。

　　3)抑菌效果的計算。病原細菌抑菌效果用抑制率衡量,抑制率=(處理抑菌圈直徑-濾紙片直徑) /濾紙片直徑×100%[11]。

　　4)拮抗菌株形態學鑒定。參照參考文獻[9],對內生菌分別進行革蘭氏染色、芽孢染色、菌體形態和大小等的測定。

　　5)拮抗菌的生長特征。把篩選出的內生細菌接種到滅菌的LB液體培養基中,恒溫振蕩培養箱28 ℃ 130 r/min培養,每隔2 h取樣一次,持續44 h。在波長為600 nm處測光密度。以光密度值(OD600 nm)為縱坐標、對應的培養時間(h)為橫坐標繪制生長曲線。

　　2結果與分析

　　2.1內生菌的分離情況

　　鐵棍山藥和惠樓山藥的不同部位共分離34株菌株,根據菌落特征初步判斷其32株為細菌,2株為放線菌。

　　2.2拮抗菌的篩選和鑒定情況

　　對山藥中分離的34株菌株進行抑菌篩選試驗(圖1、圖2),篩選出4株拮抗菌株,其抑菌情況見表1。

　　從表1可見, HNSQSY04、HNSQSY14、HNSQSY24、HNSQSY31對枯草桿菌都有抑制作用,抑制率均在24%以上,其中HNSQSY04的抑制率最大,達52%。HNSQSY31對大腸桿菌表現出抑制作用且效果不明顯,抑制率僅為12%,其他3株對大腸桿菌沒有抑制作用。

　　2.3菌株形態學鑒定情況

　　菌株形態學鑒定結果見表2、表3、圖3。由表2、表3可知,拮抗菌分別分離自惠樓山藥的底部、上部以及鐵棍山藥的中部。篩選出的4株菌株的顏色不一致, 菌落都較為濕潤、易挑取;菌株HNSQSY04和HNSQSY31來自惠樓山藥,菌落較小,邊緣不規則,且菌落較薄,革蘭氏染色分別呈紫色、紅色,細胞都呈桿狀,且前者有芽孢(圖3);HNSQSY14和HNSQSY24來自鐵棍山藥,菌落較大,邊緣規則,呈乳白色和淺棕色,革蘭氏染色呈紅色,為革蘭氏陰性菌,無芽孢。

　　2.4拮抗菌的生長特征

　　拮抗菌的生長特征見圖4。菌株HNSQSY04和HNSQSY24的潛伏期較短,4 h開始進入對數生長期,可見這2株的適應能力均較強,但后者的對數生長期較短,培養9 h已進入穩定期;而HNSQSY14和HNSQSY31在培養8 h后進入對數生長,14 h后進入穩定期,約31 h后,4株菌株可能因產生的次生代謝產物或營養匱乏開始進入衰亡期。

　　根據菌株的菌落特征,革蘭氏染色、芽孢染色和菌體形態、大小特征,根據參考文獻[12,13]進行鑒定,HNSQSY04符合芽孢桿菌屬特征,HNSQSY14、HNSQSY24和HNSQSY31均有桿菌的特征。

　　3小結與討論

　　1)以山藥為材料,在從山藥中分離出的34株菌株中發現有4株對枯草芽孢桿菌有抑菌作用,占總菌數的11.76%,抑菌率均在24%以上,其中菌株 HNSQSY04對枯草芽孢桿菌的抑菌效果最為明顯,抑菌率達52%。而對大腸桿菌僅有1株有抑制作用。說明來自同一種宿主的內生菌對不同病原菌有不同的抑菌活性。但是內生菌在活體上對病原菌的抑制能力是否和體外一致,還需進一步的驗證。

　　2)植物內生菌與寄主植物經長期的協同進化,形成互相依賴、和諧共處的關系,寄主植物為內生菌提供生境和生長發育所需的營養,植物體內有些內生菌對病原物具有拮抗作用或誘導寄主植物產生抗性,從而提高寄主植物的抗病性[14],能控制作物病害的內生菌是一種潛在而豐富的生防資源。內生菌在植物體內長期進化,可能擁有部分與宿主相同的基因,也可產生與宿主相同或相似的活性成分[15],宿主可為進行內生菌代謝產生活性成分的機理研究提供材料。

　　3)本試驗從鐵棍山藥和惠樓山藥中分離得到的內生菌株都屬于桿菌,但具體的種屬劃分還需對內生菌進行生化試驗、16S rDNA序列測定等進一步研究。這些菌株能否增加山藥的抗病性,能否對除試驗所用病原菌以外的病原菌有抑菌作用,還需進一步研究。

　　參考文獻:

　　[1] PETRINI O.Fungal endophytes of tree leaves[A]. ANDREWS JH. HIRANO S S. Microial Ecology of Leaves[M].New York:Springer Vedag,1991.

　　[2] 張建新, 劉起麗, 趙丹丹,等. 鐵棍山藥內生菌的分離及對白菜軟腐菌拮抗菌的篩選[J]. 河南農業科學, 2009(10): 94-96.

　　[3] 冉國華,張志元.植物內生菌研究及其應用[J].海南大學學報(自然科學版),2004, 22(4):366-370.

　　[4] FIORE S D, GALL M. Endophytic bacteria: Their possible role in the host plant[A]. FENDRIK I. Azospirillum VI and Related Microorganisms[M]. Berlin: Springel Vefiag, 1995.

　　[5] 朱育菁, 陳璐, 藍江林,等. 茶葉內生菌的分離鑒定及其生防功能初探[J]. 福建農林大學學報(自然科學版), 2009, 38(2):129-134.

　　[6]趙龍飛. 惠樓山藥內生細菌的分離和特性研究[J].食品工業, 2012,33(4): 79-82.

　　[7]張志東, 謝玉清, 楚敏, 等. 山藥內生菌的分離及菌種鑒定研究[J]. 新疆農業科學,2010, 47(1):126-129.

　　[8] 詹壽發, 彭琴,甘金蓮,等. 野生山藥與栽培品種內生真菌多樣性研究[J].廣東農業科學,2012,39 (21):170-172.

　　[9] 黃秀梨. 微生物學實驗指導[M]. 北京: 高等教育出版社, 1999.