秈粳雜交水稻是一種雜交品種，具有產(chǎn)量高、品質(zhì)高的優(yōu)點(diǎn)，也具有較高的研究價(jià)值，本文主要研究秈粳雜交水稻的遺傳多樣性。

　　《雜交水稻》是國家雜交水稻工程技術(shù)研究中心和湖南雜交水稻研究中心主辦、對(duì)國內(nèi)外公開發(fā)行、專門報(bào)道雜交水稻的技術(shù)類科技期刊。以廣大從事雜交水稻研究、開發(fā)、經(jīng)營、推廣和生產(chǎn)各個(gè)環(huán)節(jié)的人員，包括大中專院校、科研機(jī)構(gòu)、種子生產(chǎn)和經(jīng)營部門、推廣部門及生產(chǎn)單位的有關(guān)人員為主要讀者對(duì)象。

　　水稻秈粳亞種間雜種一代蘊(yùn)藏著巨大的雜種優(yōu)勢，福建農(nóng)林大學(xué)作物遺傳育種研究所進(jìn)行了長期探索，認(rèn)識(shí)到通過基因的不斷聚合和累加，優(yōu)良株型和高產(chǎn)與優(yōu)質(zhì)、抗逆性、適應(yīng)性相結(jié)合是行之有效的選育實(shí)用型強(qiáng)優(yōu)勢秈粳亞種間雜交稻的育種策略，依據(jù)這一育種策略，構(gòu)建了水稻秈粳亞種間育種系譜。

　　分子標(biāo)記是檢測種質(zhì)資源遺傳多樣性的有效工具。常見的分子標(biāo)記有：RFLP標(biāo)記、RAPD標(biāo)記、SSR標(biāo)記、AFLP標(biāo)記、CAPS標(biāo)記、SNP標(biāo)記、SSCP標(biāo)記等，雖然它們各有許多優(yōu)點(diǎn)，但都存在明顯的不足之處。ILP(IntronLengthPolylnorphisms)標(biāo)記即內(nèi)含子長度多態(tài)性分子標(biāo)記是基于己經(jīng)測序的兩個(gè)秈粳亞種基因組序列(Nippornbare和9311)上開發(fā)的一種新型分子標(biāo)記，具有數(shù)量多(總數(shù)達(dá)5811個(gè))、多態(tài)性高(在日本晴和9311之間為100%)、檢測方便、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，而且通用性好、單拷貝且共顯性等優(yōu)點(diǎn)。ILP標(biāo)記作為一種新型的分子標(biāo)記尚未有大量的報(bào)道。本研究利用ILP標(biāo)記技術(shù)作為遺傳多樣性的研究手段探討育種系譜的親緣關(guān)系，對(duì)豐富分子標(biāo)記在水稻遺傳方面的應(yīng)用和從分子水平揭示水稻類型均具有重要的理論意義，也為水稻超高產(chǎn)育種研究提供科學(xué)依據(jù)。

　　1材料與方法

　　1.1試驗(yàn)材料

　　1.1.1供試材料

　　本研究以構(gòu)建水稻秈粳亞種間雜交種質(zhì)創(chuàng)新系譜中的20個(gè)親本和30個(gè)不同階段的育成品系為試驗(yàn)材料，用日本晴和93-11作為對(duì)照標(biāo)記來揭示其遺傳多樣性。

　　1.1.2ILP引物

　　ILPs標(biāo)記是根據(jù)已公布的秈稻品種9311和粳稻品種日本晴的全基因組序列開發(fā)的一種內(nèi)含子長度多態(tài)性標(biāo)記(Wangeta1.2005)，由吳為人教授惠贈(zèng)。ILP引物從http://ibi.zju.edu.cn/ILPs/index.htm上獲得秈粳特異引物，從5811個(gè)候選的ILP標(biāo)記中研發(fā)出173個(gè)ILP標(biāo)記，從中檢測到60對(duì)ILP標(biāo)記應(yīng)用于水稻秈粳檢測。引物合成來自上海生物工程有限公司(北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)責(zé)任有限公司合成)，自編號(hào)分別為1-62號(hào)，共124個(gè)引物。

　　1.2實(shí)驗(yàn)方法

　　1.2.1親本葉片DNA的提取

　　采用CTAB法并加以改進(jìn)。

　　1.2.2PCR反應(yīng)體系的建立

　　在冰盒上建立ILP的PCR反應(yīng)體系(15μL)。即模板：DNA(50ng/μL)2.0μL;dNTP：(2.5mmol/L)0.3μL;引物：(50ng/ul)1.5μL;TaqDNA聚合酶：(5U/μL)0.15μL;MgCl：(10mmol/L)0.75μL;10×PCRBuffer：1.25μL;雙蒸水：9.05μL。

　　1.2.3PCR反應(yīng)程序

　　94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s，59℃退火30s(每循環(huán)遞解0.3℃)，72℃延伸1min，10個(gè)循環(huán)：94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，10個(gè)循環(huán);72℃延伸5min，4℃，保存。以上反應(yīng)在PTC-200擴(kuò)增儀上進(jìn)行。

　　1.2.4電泳檢測

　　PCR電泳檢測：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入3μL上樣緩沖液，上樣3μL，在DYCP-28D型電泳儀上進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。凝膠成分包括10%丙烯酰胺、0.04%過硫酸銨，0.1%TEMED，電泳緩沖液為0.5×TBE，250V電泳約1.5h。

　　1.2.5銀染法顯帶，包括以下步驟：

　　將膠放入固定液(0.5%冰醋酸+10%乙醇)，固定時(shí)間3～5min，放入0.2%AgNo3中染色8min;再用蒸餾水水洗1min，洗2次，放入0.375mol/LNaOH+0.4%甲醛中顯色，顯色至條帶清晰;保存在雙蒸水或保存在保鮮膜中可短期保存。DNA片斷的分子量大小根據(jù)L-2000DNAMarker電泳遷移距離估計(jì)。

　　1.3統(tǒng)計(jì)分析方法

　　采用人工計(jì)帶法進(jìn)行電泳結(jié)果記錄，清晰可辨的電泳條帶全部用于統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于同一引物的擴(kuò)增產(chǎn)物，按擴(kuò)增條帶的有無計(jì)數(shù)，遷移率相同的條帶記為一個(gè)位點(diǎn)，擴(kuò)增陽性賦值為“1”，陰性賦值為“0”，從而把圖形資料轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)資料并輸入EXCEL2000中建立特征數(shù)據(jù)矩陣用于進(jìn)一步分析。應(yīng)用DPS統(tǒng)計(jì)軟件，根據(jù)Nei-Li計(jì)算法求得品種間的相似系數(shù)Sij，計(jì)算公式為Sij=2Nij/(Ni+Nj)，其中Nij為品種i和品種j共有的帶數(shù)，Ni和Nj分別為第i和第j品種各自的帶數(shù)。采用類平均法(UPGMA)對(duì)其進(jìn)行聚類并作圖。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1ILPs引物篩選與擴(kuò)增

　　ILP在野生稻中的遺傳多樣性具有典型的秈粳亞種特性，能反應(yīng)秈粳亞種間的遺傳多樣性。用60對(duì)ILP引物對(duì)52份親本材料(日本晴、9311及50份秈粳材料)檢測，在52份材料中共擴(kuò)增到124個(gè)條帶，每對(duì)引物分別擴(kuò)增到2-4條，平均為2.01個(gè)條帶。45(61.4%)對(duì)ILP標(biāo)記只檢測到2種等位基因條帶，即9311帶型(TypicalIndicaAllele,)和日本晴帶型(TypicalJaponicaAllele)。

　　2引物3797

　　Fig.2primer3797

　　注：1-52分別代表9311，日本晴，KentaNangKa，嘉南9號(hào)，明恢72，2428，92gk729，97gk419，97gk1019，97gk1037，97gk2046，20gk719，47粳，華明921，WJ413，多系1號(hào)，亞恢420，明恢86，R527，MHR18，超引一號(hào)，9308，明恢398，明恢413，明恢416，明恢417，明恢419，明恢436，明恢3009，明恢502，明恢503，明恢504，明恢506，明恢507，明恢508，明恢509，明恢510，明恢511，明恢512，明恢513，明恢514，明恢515，明恢516，明恢517，明恢519，明恢523，明恢524，明恢527，明恢530，明恢532，明恢533，明恢534。

　　作進(jìn)一步檢測時(shí)，用篩選的58對(duì)ILP引物對(duì)52份試驗(yàn)材料進(jìn)行擴(kuò)增，其中引物2123和引物3797擴(kuò)增結(jié)果見上圖1、圖2。

　　2.2系統(tǒng)聚類分析

　　由圖3可知，從相似系數(shù)0.74處分開，供試的52個(gè)親本和品系經(jīng)58對(duì)水稻特異ILP引物的PCR擴(kuò)增檢測，可以明顯地分為兩大類;若從相似系數(shù)0.45處分開，供試的52個(gè)親本和品系可分為7類。但為了更清晰的界定本材料的親緣關(guān)系，本試驗(yàn)選定了從相似系數(shù)0.67處分開，可分為秈稻，中間型和粳稻三大類，這3種類中第三類最多，其中差異最大的品種間相似系數(shù)為0.51，秈型包含在該類型中，其相似系數(shù)較相近，它們之間差異不大;中間型包括4個(gè)品種;粳型雖包含較少品種(7個(gè))，但它們之間的差異較大，差異最大的品種間相似系數(shù)也有0.67。

　　3討論

　　由于環(huán)境因素的影響，傳統(tǒng)的形態(tài)特征很難鑒定出種質(zhì)資源的親緣關(guān)系。本研究采用ILP分子標(biāo)記對(duì)供試材料進(jìn)行親緣關(guān)系分析，由于ILP分子標(biāo)記所用的引物長度一般在15-20bp左右，退火溫度在55-60℃之間，保證了引物擴(kuò)增的重復(fù)性和特異性，提高了分類結(jié)果的準(zhǔn)確性，所以此方法作為秈粳亞種種質(zhì)資源的聚類分析，結(jié)果比較穩(wěn)定可靠，可為親本選配提供可靠的分子水平信息。

　　同時(shí)，我們也要注意到標(biāo)記數(shù)目的選擇對(duì)結(jié)果的可靠性有很大的影響，標(biāo)記數(shù)目太少，所獲得的結(jié)果具有較大的隨機(jī)性，并不能反映親本之間的真實(shí)親緣關(guān)系。而前人的諸多研究中，使用的標(biāo)記數(shù)量都較少，段世華等選用分布于水稻12條染色體上的25對(duì)SSR標(biāo)記，分析了生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的35個(gè)雜交水稻恢復(fù)系。朱作峰等用30對(duì)SSR標(biāo)記比較了52份不同生態(tài)型的栽培稻和34份不同省(區(qū))的普通野生稻的遺傳多樣性。謝建坤等利用14對(duì)SSLP標(biāo)記對(duì)東鄉(xiāng)野生稻進(jìn)行多樣性分析。和本研究相比，其他研究者在研究對(duì)象的數(shù)量上比本實(shí)驗(yàn)多出很多，這也決定了他們在標(biāo)記數(shù)量的選擇上不可能太多，但從本研究結(jié)果來看，標(biāo)記數(shù)量的選擇對(duì)結(jié)果具有很大的影響，只有標(biāo)記數(shù)達(dá)到一定數(shù)量，所得結(jié)果才較為可靠。

　　基于50個(gè)秈粳種質(zhì)資源的聚類結(jié)果，我們還可以從中選擇第二、第五和第六類群(以分成七個(gè)類群為例)作深入的研究，即從第二類群粳稻品系中的第1號(hào)品系，第五類群13個(gè)秈型品系中的第5、6、11、13號(hào)品系，第六類群的秈型品系第13、24號(hào)，選擇按不同年代育成主要以秈稻為主的共7個(gè)品系，作為恢復(fù)系進(jìn)一步研究。通過對(duì)其產(chǎn)量和莖桿性狀的遺傳效應(yīng)和雜種優(yōu)勢測定，分析親本遺傳特點(diǎn)與利用潛力，以便尋找到最優(yōu)配置，為今后育種方案的制訂提供依據(jù)。

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