分子標記是被廣泛應用于檢測物質遺傳性的一種方法，在農業生產中，也可以用來研究作物的遺傳性狀，本文主要探討ILP分子標記分析秈粳雜交水稻的遺傳多樣性。

　　《中國水稻科學》為中國水稻研究所主辦的全國性水稻學術性季刊，主要報道以水稻為研究對象的未經發表的中、英文原始論文。

　　水稻秈粳亞種間雜種一代蘊藏著巨大的雜種優勢，福建農林大學作物遺傳育種研究所進行了長期探索，認識到通過基因的不斷聚合和累加，優良株型和高產與優質、抗逆性、適應性相結合是行之有效的選育實用型強優勢秈粳亞種間雜交稻的育種策略，依據這一育種策略，構建了水稻秈粳亞種間育種系譜。

　　分子標記是檢測種質資源遺傳多樣性的有效工具。常見的分子標記有：RFLP標記、RAPD標記、SSR標記、AFLP標記、CAPS標記、SNP標記、SSCP標記等，雖然它們各有許多優點，但都存在明顯的不足之處。ILP(IntronLengthPolylnorphisms)標記即內含子長度多態性分子標記是基于己經測序的兩個秈粳亞種基因組序列(Nippornbare和9311)上開發的一種新型分子標記，具有數量多(總數達5811個)、多態性高(在日本晴和9311之間為100%)、檢測方便、結果穩定等優點，而且通用性好、單拷貝且共顯性等優點。ILP標記作為一種新型的分子標記尚未有大量的報道。本研究利用ILP標記技術作為遺傳多樣性的研究手段探討育種系譜的親緣關系，對豐富分子標記在水稻遺傳方面的應用和從分子水平揭示水稻類型均具有重要的理論意義，也為水稻超高產育種研究提供科學依據。

　　1材料與方法

　　1.1試驗材料

　　1.1.1供試材料

　　本研究以構建水稻秈粳亞種間雜交種質創新系譜中的20個親本和30個不同階段的育成品系為試驗材料，用日本晴和93-11作為對照標記來揭示其遺傳多樣性。

　　1.1.2ILP引物

　　ILPs標記是根據已公布的秈稻品種9311和粳稻品種日本晴的全基因組序列開發的一種內含子長度多態性標記(Wangeta1.2005)，由吳為人教授惠贈。ILP引物從http://ibi.zju.edu.cn/ILPs/index.htm上獲得秈粳特異引物，從5811個候選的ILP標記中研發出173個ILP標記，從中檢測到60對ILP標記應用于水稻秈粳檢測。引物合成來自上海生物工程有限公司(北京三博遠志生物技術責任有限公司合成)，自編號分別為1-62號，共124個引物。

　　1.2實驗方法

　　1.2.1親本葉片DNA的提取

　　采用CTAB法并加以改進。

　　1.2.2PCR反應體系的建立

　　在冰盒上建立ILP的PCR反應體系(15μL)。即模板：DNA(50ng/μL)2.0μL;dNTP：(2.5mmol/L)0.3μL;引物：(50ng/ul)1.5μL;TaqDNA聚合酶：(5U/μL)0.15μL;MgCl：(10mmol/L)0.75μL;10×PCRBuffer：1.25μL;雙蒸水：9.05μL。

　　1.2.3PCR反應程序

　　94℃預變性5min;94℃變性30s，59℃退火30s(每循環遞解0.3℃)，72℃延伸1min，10個循環：94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，10個循環;72℃延伸5min，4℃，保存。以上反應在PTC-200擴增儀上進行。

　　1.2.4電泳檢測

　　PCR電泳檢測：PCR擴增產物中加入3μL上樣緩沖液，上樣3μL，在DYCP-28D型電泳儀上進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。凝膠成分包括10%丙烯酰胺、0.04%過硫酸銨，0.1%TEMED，電泳緩沖液為0.5×TBE，250V電泳約1.5h。

　　1.2.5銀染法顯帶，包括以下步驟：

　　將膠放入固定液(0.5%冰醋酸+10%乙醇)，固定時間3～5min，放入0.2%AgNo3中染色8min;再用蒸餾水水洗1min，洗2次，放入0.375mol/LNaOH+0.4%甲醛中顯色，顯色至條帶清晰;保存在雙蒸水或保存在保鮮膜中可短期保存。DNA片斷的分子量大小根據L-2000DNAMarker電泳遷移距離估計。

　　1.3統計分析方法

　　采用人工計帶法進行電泳結果記錄，清晰可辨的電泳條帶全部用于統計分析。對于同一引物的擴增產物，按擴增條帶的有無計數，遷移率相同的條帶記為一個位點，擴增陽性賦值為“1”，陰性賦值為“0”，從而把圖形資料轉換成數據資料并輸入EXCEL2000中建立特征數據矩陣用于進一步分析。應用DPS統計軟件，根據Nei-Li計算法求得品種間的相似系數Sij，計算公式為Sij=2Nij/(Ni+Nj)，其中Nij為品種i和品種j共有的帶數，Ni和Nj分別為第i和第j品種各自的帶數。采用類平均法(UPGMA)對其進行聚類并作圖。

　　2結果與分析

　　2.1ILPs引物篩選與擴增

　　ILP在野生稻中的遺傳多樣性具有典型的秈粳亞種特性，能反應秈粳亞種間的遺傳多樣性。用60對ILP引物對52份親本材料(日本晴、9311及50份秈粳材料)檢測，在52份材料中共擴增到124個條帶，每對引物分別擴增到2-4條，平均為2.01個條帶。45(61.4%)對ILP標記只檢測到2種等位基因條帶，即9311帶型(TypicalIndicaAllele,)和日本晴帶型(TypicalJaponicaAllele)。

　　2引物3797

　　Fig.2primer3797

　　注：1-52分別代表9311，日本晴，KentaNangKa，嘉南9號，明恢72，2428，92gk729，97gk419，97gk1019，97gk1037，97gk2046，20gk719，47粳，華明921，WJ413，多系1號，亞恢420，明恢86，R527，MHR18，超引一號，9308，明恢398，明恢413，明恢416，明恢417，明恢419，明恢436，明恢3009，明恢502，明恢503，明恢504，明恢506，明恢507，明恢508，明恢509，明恢510，明恢511，明恢512，明恢513，明恢514，明恢515，明恢516，明恢517，明恢519，明恢523，明恢524，明恢527，明恢530，明恢532，明恢533，明恢534。

　　作進一步檢測時，用篩選的58對ILP引物對52份試驗材料進行擴增，其中引物2123和引物3797擴增結果見上圖1、圖2。

　　2.2系統聚類分析

　　由圖3可知，從相似系數0.74處分開，供試的52個親本和品系經58對水稻特異ILP引物的PCR擴增檢測，可以明顯地分為兩大類;若從相似系數0.45處分開，供試的52個親本和品系可分為7類。但為了更清晰的界定本材料的親緣關系，本試驗選定了從相似系數0.67處分開，可分為秈稻，中間型和粳稻三大類，這3種類中第三類最多，其中差異最大的品種間相似系數為0.51，秈型包含在該類型中，其相似系數較相近，它們之間差異不大;中間型包括4個品種;粳型雖包含較少品種(7個)，但它們之間的差異較大，差異最大的品種間相似系數也有0.67。

　　3討論

　　由于環境因素的影響，傳統的形態特征很難鑒定出種質資源的親緣關系。本研究采用ILP分子標記對供試材料進行親緣關系分析，由于ILP分子標記所用的引物長度一般在15-20bp左右，退火溫度在55-60℃之間，保證了引物擴增的重復性和特異性，提高了分類結果的準確性，所以此方法作為秈粳亞種種質資源的聚類分析，結果比較穩定可靠，可為親本選配提供可靠的分子水平信息。

　　同時，我們也要注意到標記數目的選擇對結果的可靠性有很大的影響，標記數目太少，所獲得的結果具有較大的隨機性，并不能反映親本之間的真實親緣關系。而前人的諸多研究中，使用的標記數量都較少，段世華等選用分布于水稻12條染色體上的25對SSR標記，分析了生產中廣泛應用的35個雜交水稻恢復系。朱作峰等用30對SSR標記比較了52份不同生態型的栽培稻和34份不同省(區)的普通野生稻的遺傳多樣性。謝建坤等利用14對SSLP標記對東鄉野生稻進行多樣性分析。和本研究相比，其他研究者在研究對象的數量上比本實驗多出很多，這也決定了他們在標記數量的選擇上不可能太多，但從本研究結果來看，標記數量的選擇對結果具有很大的影響，只有標記數達到一定數量，所得結果才較為可靠。

　　基于50個秈粳種質資源的聚類結果，我們還可以從中選擇第二、第五和第六類群(以分成七個類群為例)作深入的研究，即從第二類群粳稻品系中的第1號品系，第五類群13個秈型品系中的第5、6、11、13號品系，第六類群的秈型品系第13、24號，選擇按不同年代育成主要以秈稻為主的共7個品系，作為恢復系進一步研究。通過對其產量和莖桿性狀的遺傳效應和雜種優勢測定，分析親本遺傳特點與利用潛力，以便尋找到最優配置，為今后育種方案的制訂提供依據。

　　參考文獻

　　1 Grodzicker,T.et al.Physical mapping of Temeraturesensitive Mutations of adenoviruses Cold Spring HarborSymp[J].Quant.Biol,1974,39: 439-446.

　　2 Liu D L,Lovett J V,Biologically active secondary metabolites of barley.II.Phytotoxicity of barley allelochemicals[J].Journalof Chemical Ecology,1993,19:2231-2244.

　　3 趙向前.水稻內含子長度多態性分子標記的開發和應用[D].浙江大學,2007

　　4 盧泳全,汪旭升,黃偉素,等.基于水稻內含子長度多態性開發禾本科擴增共有序列遺傳標記[J].中國農業科學,2006,39(3):9-15.

　　5 現代植物生理學實驗指南[M]. 中國科學院上海植物生理研究所,上海市植物生理學會主編, 科學出版社, 1999, 337.

　　6 段世華,毛加寧,朱英國.用微衛星DNA標記對我國雜交水稻主要恢復系遺傳差異的檢測分析[J].遺傳學報.2002.29(3):250-254.

　　7 朱作峰,孫傳清,付永彩,等.用SSR標記比較亞洲栽培稻與普通野生稻的遺傳多樣性[J].中國農業科學,2002.35(12):1437-1441.

　　8 謝建坤,陳大洲,肖葉青,等.應用微衛星標記分析東鄉野生稻遺傳多樣性[J].中國農業科學,2003,36(8):873-878.