[摘要] 目的 研究Survivin在正常子宮內膜、子宮內膜不典型增生和子宮內膜樣腺癌(EA)三種組織中表達的差異。 方法 選取華北石油管理局總醫院2010年1月～2012年6月手術切除子宮并經病理證實的EA存檔標本40例(EA組)，經診刮或宮腔鏡檢查病理結果示子宮內膜不典型增生20例(AHE組)，同時選取同期因子宮脫垂或子宮肌瘤行子宮切除的正常子宮內膜20例作為對照(CON組)。通過免疫組織化學法檢測三組中Survivin表達情況的差異。應用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析。 結果 EA組的Survivin表達陽性率為90%，顯著高于CON組(75%)，差異有統計學意義(P < 0.05)。在EA組中，組織分級為G1、G2、G3級的患者Survivin陽性率分別為85.0%、90.9%、100.0%，差異有統計學意義(P < 0.05);手術-病理分期為Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期的患者Survivin陽性率分別為62.1%、85.7%、100.0%，差異有統計學意義(P < 0.05);肌層浸潤深度<1/2及≥1/2的患者Survivin陽性率分別為88.5%、92.9%，差異無統計學意義(P > 0.05);存在淋巴結轉移及無淋巴結轉移的患者Survivin陽性率為100.0%、80.6%，差異無統計學意義(P > 0.05);存在脈管浸潤及無脈管浸潤的患者Survivin陽性率分別為100.0%、84.2%，差異無統計學意義(P > 0.05)。 結論 相較于正常子宮內膜，EA組織中Survivin表達顯著增多。Survivin的陽性表達率與EA組織學分級和手術-病理分期相關，與肌層浸潤、淋巴結轉移及有無脈管浸潤無關。

　　[關鍵詞] 基礎醫學論文發表,子宮內膜樣腺癌,Survivin,免疫組織化學,組織分級,手術-病理分期

　　Expression of Survivin in endometrial carcinoma

　　WANG Lili1 ZHU Zhenlong2▲ HAO Tong3

　　1.Department of Obstetrics and Gynecology， North-China Petroleum Administration Bureau General Hospital， Hebei Province， Renqiu 062552， China; 2.Department of Pathology， the First Hospital， Hebei Medical University， Hebei Province， Shijiazhuang 050030， China; 3.Department of Pathology， North-China Petroleum Administration Bureau General Hospital， Hebei Province， Renqiu 062552， China

　　[Abstract] Objective To compare the expression of Survivin in normal endometrium， atypical hyperplasia of endometrium and endometrioid adenocarcinoma. Methods Forty cases of endometrioid adenocarcinoma samples resected from operation and confirmed by pathology were selected as EA group， 20 cases of atypical hyperplasia of endometrium (AHE) confirmed by pathologic from endocervical curettage or hysteroscopy were selected as AHE group， 20 cases of normal endometrium from hysterectomy for uterine prolapse or uterine fibroids were selected as control group (CON group) in North-China Petroleum Administration Bureau General Hospital from January 2010 to June 2012. Expression of Survivin in the three groups were detected by immunohistochemistry method. All the data was analyzed by SPSS 16.0. Results The positive expression rate of Survivin in the EA group was 90%， which was higher than that in the CON group (75%)， with statistically significant difference (P < 0.05). In EA group， the positive expression rates of Survivin in patients with organization classification of G1， G2， G3 were 85.0%， 90.9% and 100.0%， with statistically significant differences (P < 0.05); which in panties with surgery-pathological staging of Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ were 62.1%， 85.7% and 100.0%， with statistically significant difference (P < 0.05); which in patients with muscularis invasion depth<1/2 or ≥1/2 were 88.5% and 92.9%， without statistically significant difference (P > 0.05); which in patients with lymphatic metastasis or non- metastasis were 100.0% and 80.6%， without statistically significant difference (P > 0.05); which in patients with vascular invasion or non-vscular invasion were 100.0% and 84.2%， without statistically significant difference (P > 0.05). Conclusion Compared with normal endometrium， endometrioid adenocarcinoma has higher Survivin expression. The positive expression rates of Survivin are correlated with the histological grade and surgery-pathological stage of EA， but has no relationship with myometrial invasion， lymph node metastasis or vascular invasion. 　　[Key words] Endometrial carcinoma; Survivin; Immunohistochemistry; Histological grade; Surgery-pathological stage

　　子宮內膜樣腺癌(endometrioid adenocarcinoma，EA)是最常見的女性生殖系統惡性腫瘤之一。在我國，EA的發病率高居婦科惡性腫瘤的第2位[1]。迄今為止，有關EA的發病機制尚存在爭論。Survivin基因是凋亡抑制(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)基因家族的新成員，具有調節細胞有絲分裂和抑制細胞凋亡的雙重作用[2]。在眾多腫瘤和胚胎組織中都有表達，但在成熟分化細胞中完全缺失。目前針對Survivin在EA中的研究正逐步開展，已發現Survivin具有作為子宮內膜癌診斷標志物的潛力，有學者應用免疫組織化學(streptavidin-peroxidase，SP)法、逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)、Western-blot等方法對比了正常子宮內膜組織、不典型增生內膜組織和子宮內膜癌組織中Survivin水平后，認為在癌組織中，Survivin水平明顯高于正常組織和不典型增生組織，并且有可能成為治療子宮內膜癌的靶點[3-4]。本研究應用SP法檢測正常子宮內膜、子宮內膜不典型增生(atypical hyperplasia of endometrium，AHE)及EA中Survivin的表達，旨在探討其在EA發生、發展中的作用，為臨床診斷、治療EA提供理論依據。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　選取華北石油管理局總醫院2010年1月～2012年6月手術切除子宮并經病理證實的EA存檔標本40例作為EA組，年齡31～77歲，平均53.4歲。選取經診刮或宮腔鏡檢查病理結果示AHE樣本20例(AHE組)。同時選取同期因子宮脫垂或子宮肌瘤行子宮切除的正常子宮內膜樣本20例作為對照組(CON組)。依據2009年修訂的國際婦產科聯盟(FIGO)EA的手術-病理分期標準進行分期：Ⅰ期29例，Ⅱ期7例，Ⅲ期4例;組織分級[G1(高分化)：非鱗狀或桑葚狀實性生長類型為≤5%;G2(中分化)：非鱗狀或桑葚狀實性生長類型為>5%～50%;G3(低分化)：非鱗狀或桑葚狀實性生長類型為>50%]顯示，G1 20例，G2 11例，G3 9例;子宮內膜浸潤深度<1/2 26例，子宮內膜浸潤深度≥1/2 14例;淋巴結無轉移36例，有轉移4例;淋巴脈管無浸潤38例，浸潤2例。所選標本臨床病歷資料完整，術前均未行化療、放療或免疫治療等，同時排除合并有其他部位惡性腫瘤。所有標本診斷均經2名高年資病理醫師再次審核確認。所選標本蠟塊均做4 μm連續切片6張，其中3張分別行常規HE染色和SP染色，其余3張備用。

　　1.2 方法

　　1.2.1 免疫組化染色 采用SP法，嚴格按照SP試劑盒的說明書進行操作，用已知的陽性切片作為陽性對照，同時以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。具體步驟如下：將切片浸于二甲苯中5 min 2次，100%、95%、90%、85%、75%乙醇中各5 min 2次，自來水沖洗，PBS洗2次。1%甲醇雙氧水，室溫10 min，蒸餾水沖洗3次，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min。抗原微波熱修復將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)的容器中，置微波爐內加熱使容器內液體溫度保持在92～98℃并持續15 min。取出容器，室溫冷卻15 min，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min。切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min。用以防止抗原與非特異性抗體結合，甩去多余液體，不洗。切片上滴加第一抗體(兔抗人Survivin多克隆抗體的原液濃度為1 mg/mL，稀釋度為1∶10，北京博奧森生物技術有限公司)，4℃過夜，0.1 mol/L PBS洗3次× 5 min。切片上滴加生物素化的山羊抗兔第二抗體(稀釋度為1∶100，北京博奧森生物技術有限公司)，室溫下30 min，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min。切片上滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫下30 min，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min。使用DAB顯色試劑盒，1 mL蒸餾水按順序滴加顯色劑A、B、C各1滴，鏡下控制顯色時間。充分水洗。水洗后，蘇木精復染細胞核3 min，依次放入蒸餾水，70%、80%、90%、100%乙醇各20 min，二甲苯1 h時脫水，中性樹脂封片。最后選擇各組陽性和陰性組織相進行100×和200×顯微照相。

　　1.2.2 HE染色 切片常規脫蠟至水，蘇木精染色3 min，自來水沖洗;1%鹽酸乙醇分化3 s，自來水沖洗;氨水乙醇返藍5 s，自來水沖洗;伊紅染色5 s，自來水沖洗;梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂膠封片。

　　1.2.3 免疫組織化學染色結果判定 胞核中棕黃色顆粒染色深、均勻一致為陽性，胞核中未見棕黃色顆粒為陰性。實驗過程中選擇乳腺癌標本做陽性對照。每例隨機選出10個不重復、不重疊的高倍鏡視野，計數陽性細胞數及所有細胞數，計算陽性細胞率=Σ陽性細胞數/Σ總細胞數×100%。染色強度：基本不著色為0分，淺黃色為1分，橘黃色為2分，棕黃色為3分;著色細胞占計數細胞百分率：≤5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%為3分。將每張切片染色程度與染色細胞百分率得分相加之和為其最后得分。標本染色得分在0～6分之間，其中，0～2分為陰性，≥3分為陽性。

　　1.3 統計學方法

　　采用SPSS 15.0統計學軟件進行數據分析，計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。 　　2 結果

　　2.1 各組Survivin表達情況

　　在正常子宮內膜組織Survivin不表達或僅有少部分腺體表達，且呈弱陽性(圖1A)，而Survivin在EA和AHE中的表達呈強陽性(圖1B、C)。統計結果顯示：EA組的Survivin表達陽性率為90%(36/40)，AHE組的Survivin表達陽性率為75%(15/20)，CON組的Survivin表達陽性率僅為20%(4/20);其中，EA組及AHE組中Survivin表達陽性率顯著高于CON組，差異有統計學意義(P < 0.05)，EA組的Survivin表達陽性率較AHE組有增高趨勢，但差異無統計學意義(P > 0.05)。

　　A：CON組(弱陽性);B：AHE組(強陽性);C：EA組(強陽性)

　　圖1 各組子宮內膜組織Survivin表達情況(SP法，100×)

　　2.2 EA組臨床病理參數與Survivin表達的關系

　　2.2.1 EA組織分級與Survivin表達的關系 在EA組中，組織分級為G1級的患者Survivin陽性率為85.0%(17/20)，G2級Survivin陽性率為90.9%(10/11)，G3級Survivin陽性率為100.0%(9/9)。統計學比較顯示，不同組織分級患者Survivin表達差異有統計學意義(P < 0.05)。

　　2.2.2 EA組手術-病理分期與Survivin表達的關系 在EA組中，手術-病理分期為Ⅰ期的患者Survivin陽性率為62.1%(18/29)，Ⅱ期Survivin陽性率為85.7%(6/7)，Ⅲ期Survivin陽性率為100.0%(4/4)。統計學比較顯示，不同手術-病理分期分級患者Survivin表達差異有統計學意義(P < 0.05)。

　　2.2.3 EA的肌層浸潤深度與Survivin表達的關系 在EA組中，肌層浸潤深度<1/2的患者Survivin陽性率為88.5%(23/26)，肌層浸潤深度≥1/2的患者Survivin陽性率為92.9%(13/14)。統計學比較顯示，不同肌層浸潤深度患者Survivin的陽性表達率差異無統計學意義(P > 0.05)。

　　2.2.4 EA的淋巴結轉移與Survivin表達的關系 在EA組中，存在淋巴結轉移的患者Survivin陽性率為100.0%(4/4)，無淋巴結轉移患者Survivin陽性率為80.6%(29/36)。統計學比較顯示，不同淋巴結轉移患者Survivin的陽性表達率差異無統計學意義(P > 0.05)。

　　2.2.5 EA的脈管浸潤與Survivin表達的關系 在EA組中，存在脈管浸潤的患者Survivin陽性率為100.0%(2/2)，無脈管浸潤的患者Survivin陽性率為84.2%(32/38)。統計學比較顯示，不同脈管浸潤患者Survivin的陽性表達率差異無統計學意義(P > 0.05)。

　　3 討論

　　1997年，Ambrosini等[2]率先在人類基因組庫中通過篩選、分離等手段，最終克隆出Survivin。Survivin基因是一種新型凋亡抑制基因，其定位于17號染色體的q25區，編碼產生Survivin蛋白。Survivin蛋白是抗凋亡作用最強但分子量最小的凋亡抑制蛋白(IAP)，它在惡性腫瘤組織及胚胎中表達豐富，在子宮內膜、胸腺、胎盤等組織也可有少量表達，但其在正常的分化成熟組織以及癌旁組織中則為低表達或無表達。Survivin基因的特異性表達的特點使其在腫瘤研究領域日益受到重視。

　　先后有報道證實，Survivin基因在肝癌、膽囊癌、膀胱癌、前列腺癌、宮頸癌、乳腺癌、鼻癌及神經膠質瘤等腫瘤組織中高表達，并與腫瘤的治療及預后相關[5-13]。Takai等[4]研究發現，Survivin基因在正常子宮內膜組織中的表達極低，但在EA組織中表達的陽性率卻極高。本研究結果也顯示了相似的結果，即EA組和AHE組中Survivin的表達率分別為90%(36/40)和75%(15/20)，均明顯高于正常子宮內膜組[20%(4/20)，P < 0.05]，提示Survivin基因在EA的發生中起著重要作用。

　　有學者發現Survivin基因表達的強度與腫瘤的組織分級、臨床分期及組織浸潤深度等呈正相關，Survivin基因表達增高往往預示治療困難及預后較差[9-10， 12]。Stefansson等[14]研究認為，Survivin基因表達的強度與EA的組織分級、臨床分期及肌層浸潤深度呈正相關，且Survivin蛋白與EA惡性程度及臨床預后密切相關，其高表達提示EA患者的低生存率[4，14]。但對此一些學者則持相反觀點，認為Survivin基因表達的強度與EA的組織分級、臨床分期及生存率不存在相關性[15-16]。本研究發現，Survivin的表達強度與EA組織學分級和手術-病理分期存在一定相關性，與肌層浸潤、淋巴結轉移及有無脈管浸潤無關。手術-病理分期Ⅲ期患者EA表達率明顯高于Ⅰ期患者，說明腫瘤組織分化越差，分期越嚴重，組織中Survivin蛋白的表達水平就越高。因此，筆者推斷Survivin蛋白在腫瘤形成的各個階段都起了至關重要的作用，與Takai等[4]的報道相符。Eekanli等[15]研究表明，Survivin蛋白表達超過正常值即可以判定組織存在癌變可能，提示Survivin蛋白具有篩查診斷早期腫瘤的價值，是EA形成過程中的早期事件。本研究中20例正常子宮內膜中有4例表達呈陽性，這可能與子宮內膜細胞增殖活躍有關，提示應對該類患者進行密切隨訪。

　　綜上所述，Survivin蛋白可能通過抑制細胞凋亡程序，并能維持或促進基因缺陷的細胞生存優勢，進而導致基因的突變和細胞的轉化，因此，Survivin在EA的發生、發展中發揮重要作用。 　　[參考文獻]

　　[1] Kellert IM，Botterweck AA，Huveneers JA，et al. Trends in incidence of and mortality from uterine and ovarian cancer in Mid and South Limburg，The Netherlands，1986-2003 [J]. Eur J Cancer Prev，2009，18(1)：85-89.

　　[2] Ambrosini G，Adida C，Altieri DC. A novel anti-apoptosis gene， survivin， expressed in cancer and lymphoma [J]. Nat Med，1997，3(8)：917-921.