硒是哺乳動物必需的一種微量元素，缺硒會導致多種病理狀態(tài). 硒蛋白是微量元素硒發(fā)揮生物學功能的主要形式. 為了進一步探討硒蛋白P在腫瘤中的作用，我們利用免疫組化技術觀察該抗體在結腸癌中的表達。

　　《癌癥》雜志是由中華人民共和國教育部主管，中山醫(yī)科大學腫瘤防治中心(世界衛(wèi)生組織癌癥研究合作中心)主辦，美國LANDES出版社協(xié)辦的核心科技期刊。創(chuàng)刊于1982年2月，月刊，大16開，112頁，進口銅版紙彩印，國內外公開發(fā)行。

　　1對象和方法

　　1.1對象結腸癌30例，為第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院普通外科200310/200505手術切除標本,男17例，女13例. 年齡45~79(平均61.4)歲;高分化10例，中分化5例，低分化15例;腫瘤TNM分期：I期8例，II期9例，III期13例. 另取30例原發(fā)器官正常結腸組織作為對照.

　　兔抗人硒蛋白P多克隆抗體，由中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所分子腫瘤學國家重點實驗室先期制備保存. 免疫組化試劑盒購自北京中杉公司.

　　1.2方法① 將組織蠟塊切片，常規(guī)脫臘：70℃烤片2 h，二甲苯10 min×2次. 水化： PBS洗3 min×2次. ② 30 mL/L H2O2溶液室溫處理10 min，雙蒸餾水洗3 min×3次. ③ 在0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)92~98℃水浴中處理25 min修復抗原，自然冷卻到室溫. 緩沖液洗3min×2次. ④ 分別用正常山羊血清和卵白素室溫封閉2 h. ⑤ 滴加稀釋的一抗SelP多克隆抗體(1∶50)，37℃孵育4 h. PBS洗3 min ×3次. ⑥ 生物素結合的羊抗兔IgG二抗和ABC復合物室溫分別孵育2 h. ⑦ 滴加DAB溶液顯色，注意觀察顏色變化，及時終止，沖洗. ⑧ 蘇木素復染，梯度乙醇脫水，封片.

　　以免疫組化試劑盒中的陽性片作陽性對照，以0.01 mol/L PBS(pH 7.4)和正常羊血清分別替代一抗和二抗作為陰性對照. 陽性染色為棕黃色，定位于細胞胞質和細胞膜. 染色陽性細胞數(shù)量評分： 0分(全片未見著色或少于5%細胞散在著色)，1分(5%~25%細胞著色)，2分(25%~50%細胞呈陽性)，3分(50%~75%細胞染色陽性)，4分(>75%細胞染色陽性). 染色強度評分：0分(陰性)，1分(弱陽性)，2分(中等陽性)，3分(強陽性). 染色陽性細胞數(shù)量評分與染色強度評分之積為最終染色評分標準：0分(陰性)，0~4分(弱表達)，4~8分(中等表達)，8~12分(強表達).

　　統(tǒng)計學處理: 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包，用非參數(shù)檢驗，兩個獨立樣本W(wǎng)ilcoxon檢驗進行統(tǒng)計學分析. P<0.05認為存在顯著性差異.

　　2結果

　　2.1硒蛋白P在腫瘤及正常對照組織中的表達免疫組化染色結果見表1.表1硒蛋白P在腫瘤及正常對照組織中的表達 陽性信號為棕褐色或棕黃色，呈彌漫狀或片狀分布. 硒蛋白P染色主要定位于細胞胞質及胞膜中，細胞外間質也有部分染色，而細胞核無染色.在結腸癌中硒蛋白P表達與分化程度有關，尤其是伴黏液分泌者中低表達明顯;細胞富于黏液成分或杯狀細胞無論是正常還是腫瘤中表達均為陰性.硒蛋白P在正常對照組織中的陽性率表達高于結腸癌中的表達(圖1).

　　2.2硒蛋白P在腫瘤中的表達與其分化程度及臨床分期的關系見表2.

　　3討論

　　目前硒蛋白P真正的生物學功能還不清楚，特別是與腫瘤發(fā)生的關系不甚明了. Burk等[1]認為硒蛋白P可能是自由基的清除劑. 硒蛋白P可能由于其抗氧化的保護性作用，通過消除自由基，減少DNA損傷，預防突變阻止腫瘤的發(fā)生[2-3]. 其他可能的機制是調節(jié)機體免疫系統(tǒng)，增強機體免疫系統(tǒng)的抗癌活力;拮抗腫瘤細胞內cGMP的增加，抑制DNA, RNA及蛋白質的合成;抑制腫瘤病變中新生血管生成[4-6].

　　A: 結腸癌組織; B: 正常結腸組織.

　　圖1硒蛋白P的表達ABC ×200 表2硒蛋白P在結腸癌組織中的表達與臨床病理學因素的關系現(xiàn)認為血漿中硒蛋白P水平和腫瘤的發(fā)生呈負相關，PerssonMoschos等[7]發(fā)現(xiàn)對應于硒蛋白P濃度的5個水平，從低到高，發(fā)生腫瘤的相對危險度分別為5.2, 2.3, 2.9, 2.2和1.0，硒蛋白P水平最低組發(fā)生呼吸道和消化道腫瘤的概率分別是硒蛋白P高水平組的6倍和3.4倍，表明隨著硒蛋白P濃度增高，腫瘤發(fā)生的危險度降低.

　　Mork等[2]發(fā)現(xiàn)，結直腸腺瘤較鄰近正常黏膜硒蛋白P mRNA表達下降，并認為在結直腸腺瘤硒蛋白P mRNA表達下調可能是腺瘤到腺癌發(fā)展過程中的一個早期事件，這種下調使硒蛋白P表達減少，導致DNA受到氧化損傷，從而發(fā)生基因突變，引起腫瘤的發(fā)生和促進腫瘤的發(fā)展，而且硒蛋白P和同屬硒蛋白的胃腸谷胱甘肽過氧化物酶在抗氧化細胞抵抗腺瘤腺癌演變中起到互補作用. AlTaie等[3]證實在結直腸癌中其mRNA表達明顯減少或缺失，表明在結腸癌中可能存在著硒蛋白P基因的突變和轉錄異常.

　　本結果提示，硒蛋白P表達在結腸癌與正常組織差異顯著，表達與分化程度有關. 伴黏液分泌者中低表達，細胞富于黏液成分或杯狀細胞無論是正常還是腫瘤中表達均為陰性. 或許提示正常腸黏膜杯狀細胞分泌功能與硒蛋白P表達無關;同樣，其在結腸癌中的表達與腫瘤分期無關. 在結腸癌硒蛋白P低表達，除了受硒營養(yǎng)狀況(血漿中硒蛋白P濃度)的影響，可能存在著硒蛋白P基因的突變和轉錄異常[3]，失去這一保護性因素，可能導致了腫瘤的發(fā)生.

　　【參考文獻】

　　[1] Burk RF,Hill KE. Regulation of selenoproteins [J]. Annu Rev Nutr, 1993,13:65-81.

　　[2] Mork H, AlTaie OH, Bahr K, et al. Inverse mRNA expression of the selenocysteinecontaining proteins GIGPx and SeP in colorectal adenomas compared with adjacent normal mucosa[J]. Nutr Cancer, 2000,37(1):108-116.

　　[3] AlTaie OH, Uceyler N, Eubner U, et al. Expression profiling and genetic alterations of the selenoproteins GIGPx and SePP in colorectal carcinogenesis[J]. Nutr Cancer, 2004,48(1):6-14.

　　[4] Ganther HE. Selenium metabolism and mechanisms of cancer prevention[J]. Adv Exp Med Biol, 2001,492:119-130.

　　[5] Raich PC, Lu J, Thompson HJ, et al. Selenium in Cancer Prevention:Clinical Issues and Implications[J]. Cancer Invest, 2001,19(5):540-553.

　　[6] Brown KM,Arthur JR.Selenium,selenoproteins and human health:a review[J]. Public Health Nutr, 2001,4(2B):593-599.

　　[7] PerssonMoschos ME, Stavenow L, Akesson B, et al. Selenoprotein P in plasma in relation to cancer morbidity in middleaged Swedish men[J]. Nutr Cancer, 2000,36(1):19-26