摘要：骨髓8間充質干細胞是存在于骨髓中的除造血干細胞以外的另外的另一類具有多向分化潛能的干細胞。在一定的誘導條件下，這類細胞可定向分化為造血系統以外多種組織細胞，特別是中胚層和神經外胚層來源的組織細胞。例如成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、腱細胞、肌肉細胞、神經細胞等。骨髓間充質干細胞具有貼壁生長的特性，能在體外易分離和擴增，還可用于外源基因的轉入和表達，在人類醫學上被認為是一種理想的治療性細胞和基因治療中的靶細胞。本文針對骨髓間充質干細胞的研究進展和在臨床醫學上的應用進行綜述。
　　關鍵詞：骨髓間充質干細胞；綜述；定向引導；
　　組織工程骨髓間充質干細胞（bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCS）也稱骨髓基質來源干細胞，因呈成纖維樣外觀，所以也稱為集落形成單位成纖維細胞（colony—formingunitesfibroblasts,CFUF）,至今還沒有相對統一的命名。但大量的研究表明：BMSC是可以分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞、神經細胞、腱細胞等的一種具有多項分化潛的能干細胞。在體外易分離和擴增，且便于細胞移植。此外，BMSC獨特的增殖分裂模式使外源基因易于導入和表達。因此，BMSC在組織工程、細胞治療和基因治療中具有廣闊的應用前景。
　　骨髓間充質干細胞的研究歷史
　　130年前，德國病理學家Cohnhein在研究傷口愈合過程中首次提出骨髓中存在充質干細胞(MSC)的觀點。他是在試驗中給動物靜脈注射一種不溶性染料analine，然后在肢體遠端人為造成損傷。結果在傷口愈合部位有含染料的細胞，包括炎癥細胞與成纖維樣細胞。后來由于受到條件的限制，這些研究未能繼續進行。直到1976年，Friedenstein等，從骨髓中分離得到長梭狀、成纖維細胞樣、以貼壁生長并可形成集落的細胞群，即成纖維集落形成單位。1987年，Friedenstein等又發現在塑料培養皿中培養的貼壁骨髓單核細胞在特定的條件下可分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞和成肌細胞，并且擴增20－30代后仍保持其多向分化潛能。
　　骨髓間充質干細胞的分離與培養
　　目前，BMSC的分離純化及體外培養方法，由于各實驗室的條件不同，許多實驗室仍是在Friedenstein等方法基礎上進行一定的改進，即根據BMSC易于黏附塑料底物的特性來實現分離。每次更換培養基時，先吸去培養液，再用Tyrode’S平衡鹽溶液沖洗2-3遍，沖去懸浮生長的造血干細胞，再加入新鮮培養基，稱為貼壁篩選法；根據BMSC與其它細胞密度不同，采用細胞分離液來分離。把分離的骨髓緩慢轉入細胞分離液表面，進行離心，再收獲分離單核細胞進行培養，即密度梯度離心法；根據細胞大小或者細胞表面的一些特殊標志來進行分離，即流式細胞儀分選法。這一方法已商業化，分選純度可達98%以上。用貼壁篩選法分離得到的是一個異質細胞群，含有多種其它成分。因為BMSC是一類比較脆弱的祖細胞，當經過流式細胞儀時可導致某些活性完全丟失，而用密度梯度離心法可得到形態和性質均一的BMSC。因此，目前廣泛采用的是利用密度梯度離心法來分離純化BMSC。國外較為關注的另一種方法是依據BMSC對生長因子的反應性不同，通過選擇適當的因子刺激增殖而獲得含有較高比例BMSC。此外，在國外還建立了一種簡單經濟高效的分離BMSC的方法，即利用一種具有3mm孔徑的塑料培養皿從骨髓中篩選MSC，這種方法篩選出來的BMSC均質性大于98％，并具有自我增殖和更新及分化為各種結締組織的能力。
　　常用的細胞培養液有DMEM-F12、RPMI1640等。同時在培養基中還要加入一定比例的動物血清，一方面血清富含細胞生長、繁殖所需要的營養成分，另一方面含促進細胞貼壁的因子，使細胞能更好地貼壁生長，并且還能緩沖pH和抑制蛋白酶的作用。1995年Lennon等建立了一種無血清培養體系。由于要加入一些價格昂貴的因子，因此，這種培養方法未能得到推廣。隨著對BMSC研究的不斷深入，今后用無血清培養基體外培養BMSC也是一種必然的趨勢。
　　骨髓間充質干細胞的生物學特性
　　體外培養的BMSC體積小，結構簡單，成梭形，核質比較大，能以自我繁殖的方式增殖，不表達分化相關的細胞標志，也不表達造血干細胞的表面標志。
　　BMSC最重要的特性是具有多項分化潛能，針對不同的分化方向采用不同的誘導劑，通過體外貼壁培養，可分化為多種造血以外的組織細胞，特別是來源于中胚層和神經外胚層的組織細胞。近20年來發現了多種BMSC體外誘導條件。采用地塞米松，磷酸甘油和抗壞血酸等單獨或聯合誘導，可以分化成為骨細胞，形成聚集體或結節，堿性磷酸酶活性增高；在高糖DMEM培養基中加入地塞米松、胰島素、TGF-1等可誘導BMSC向成軟骨細胞分化；另外，用a.巰基乙醇（BME）、二甲基亞砜（DMSO）和丁羥基茴香醚（BHA）等一些具有還原性的物質成功誘導了MSC轉變為神經元，并表達神經元特有的標記，例如：神經微絲（NF.M）、神經元核心抗原（NeuN）、tau蛋白以及神經特異烯醇化酶（NSE）等；在培養液中加入1－甲基.3－異丁基黃嘌呤、地塞米松、胰島素、消炎痛時，則細胞內含脂豐富的小泡逐漸增多，即形成脂肪細胞。目前，仍未篩選到BMSC上特有的標記分子，尚無直接方法可進行鑒定。各實驗室鑒定BMSC的方法都是通過在培養過程中出現分化表型，然后逆推得知是否為MSC.對細胞表面蛋白如SH-2,SH-3,SH-4,SB-10,
　　CD29，CD84,CD71,CD90,CD106,CD120a和CD124等成陽性反應，而
　　CDla,CD31,CD34,CD14,CIM5,CD56和ESA則為陰性。在篩選時陰性反應也可以作為一定的參考。據報道，BMSC的表面抗原并不特別，它具體有間質細胞、上皮細胞和內皮細胞表面抗原的特征，即它可表達多種黏附相關分子。例如：整合素亞基a4、a5、1以及整合素3、5，ICAM.1，CD44等。BMSC除了可分化形成多種基質細胞外，它本身還可分泌多種造血生長因子來支持造血。例如白介素、趨化因子等。
　　骨MSC在臨床上的應用及前景
　　BMSC在體外易于分離培養，并能保持其多向分化潛能，遺傳背景穩定，植入體內無免疫排斥反應，即使是同種異體移植，由于BMSC屬于未分化的前體干細胞，其細胞表型的分化尚不成熟，BMSC移植后有排斥也十分微弱。BMSC可被作為細胞工程中較理想的種子細胞，并很有可能作為自體細胞構建的組織工程化骨組織應用于臨床。目前，對BMSC在骨與軟骨損傷方面的研究較深，美國bruder采用擴增后的人BMSC作為移植物進行骨再生研究，結果發現BMSC產生新的骨組織，可用于重建臨床上明顯的骨缺失，為自體骨移植開辟了新渠道。在體外將覆蓋有BMSC的陶瓷支架植入狗股骨缺損處，結果發現比單純植入陶瓷支架促進骨折愈合的效果要好。同樣，將覆蓋有已分化為軟骨細胞的碳纖維網植入兔受損關節部位，結果也顯示出比單純植入碳纖維網更明顯的促進關節軟骨修復的作用。在Ⅰ期臨床上，BMSC已作為在大劑量化療后骨髓移植的輔助治療。Koc等將自體造血干細胞與培養擴增后的BMSC共輸入高劑量化療后的晚期乳腺癌患者，可使造血功能恢復加快。將人BMSC注入大鼠紋狀體內，結果發現BMSC向鄰近腦組織遷移，并逐漸丟失BMSC上的標志蛋白，例如：骨膠原蛋白、纖維連接蛋白，并且表現出與神經膠質細胞一樣的特征（GFAP）；將雄性大鼠的骨髓植入放射線致死量照射的同系雌性大鼠體內，通過Y染色體探針原位雜交和不同基因表型的檢測發現，該大鼠肝臟有供體骨髓來源的肝臟卵原細胞，且能夠分化為成熟的肝臟細胞。利用培養自體的BMSC懸浮在膠原凝膠的載體上，在兔的跟腱作1cm長的斷口損傷，把細胞－凝膠復合物種植在肌腱的接縫上，同時在對側肌腱作較小的切口，結果發現裝載BMSC的種植物能夠使損傷的肌腱在生化特性、結構和功能上得到修復。近來，BMSC在分子細胞生物學方面的應用吸引了越來越多的科研工作者的關注。BMSC由于獨特的生物學特性使得外源基因易表達。在體外將BMSC的基因修飾后用于臨床治療，可以避免傳染載體內產生的副作用。大量的實驗證明，貼壁生長的BMSC經過介導容易導入外源性基因，并能在體能長期高效的表達，研究證實，使用包含猿白血病病毒外殼的逆轉錄病毒載體將VⅢ因子基因轉入人或鼠的BMSC具有很高的傳染率。目前在人和動物的BMSC中已成功轉入了幾種不同外源基因，且未能引起細胞性能的缺陷。同時也可以在體外跟蹤含遺傳標記的BMSC，將正常基因導入人發生異常突變的動物體內。例如有人將標記rhBMP的基因導入動物體內的BMSC內，將BMSC移植回動物大腿骨的骨損傷部位，在第8周觀察到了骨恢復。有實驗證明基因修飾后BMSC能夠存活于大腦，并激活和表達基因產物。例如將膠質細胞來源的神經營養因子（GDNF）的基因轉入到雄性鼠的BMSC中，然后把這些細胞靜脈注入到健康雄性鼠體內，8周后建立帕金森氏癥的模型，觀察轉入GDNF基因后的BMSC對黑質細胞的保護作用，結果發現酪氨酸酶(TH)呈陽性，黑質神經元明顯高于對照組；Schwarz等用基因工程技術將TH和GTP水解酶Ⅰ的基因轉入BMSC中，再將其輸入到帕金森氏癥的兔模型中，結果發現被轉入的基因能夠在體內持續表達9d；在血友病治療方面，baroffio等將人的FIXcDNA經逆轉錄病毒介導轉入BMSC中，然后靜脈注入狗體內，第2d檢測到人FIX水平達0.233ug/ml,可大大減輕B型血友病病人的癥狀。除此之外，經過體外大量擴增基因操作的BMSC還可治療許多其他疾病。

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