苦木為我國南方地區常用中藥，為苦木科苦樹屬植物Picrasmaquassioides（D.Don）Benn.的干燥枝和葉，性寒，味苦，有清熱解毒，祛濕的功效，用于風熱感冒，咽喉腫痛，濕熱瀉痢，濕疹，瘡癤，蛇蟲咬傷[1]。化學成分研究表明，苦木中主要含有生物堿類，內酯類，黃酮類等化學成分[2-6]，其中生物堿類成分主要為鐵屎米-6-酮型及β-咔巴啉型。

　　[摘要]建立RP-HPLC同時測定苦木中4個生物堿與1個黃酮成分含量的方法，并進行多批次藥材成分分析，為苦木質量評價提供依據。采用KromasilC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脫，流速1.0mL・min-1，檢測波長254nm。4個生物堿苦木堿L，苦木堿B，苦木堿F，苦木堿D和黃酮高麗槐素的標準曲線及線性范圍依次為Y=6525.6X+37.25（0.009～1.780μg，r=0.9968），Y=3662.3X+41.55（0.005～0.920μg，r=0.9995），Y=3763.1X+146.87（0.015～3.060μg，r=0.9990），Y=2174.1X+21.52（0.003～0.620μg，r=0.9995），Y=276.25X+7.65（0.010～1.960μg，r=0.9989），平均加樣回收率在98.02%～101.8%，RSD%在1.2%～2.8%，重復性及精密度良好。經過系統的方法學考察，該法簡便，準確，可用于苦木藥材的質量分析及控制。

　　[關鍵詞]醫學論文發表,苦木,β-咔巴啉類生物堿,鐵屎米-6-酮類生物堿,二氫異黃酮,RP-HPLC

　　《中國藥典》2010年版（一部）收載苦木的質量標準為性狀鑒別，顯微鑒別及生物堿薄層色譜鑒別，無含量測定項。苦木及含苦木制劑的質量分析報道多為HPLC測定其中鐵屎米酮型生物堿的含量[7-10]，而對β-咔巴啉型生物堿及黃酮類成分的質量控制尚鮮見報道。為有效控制苦木質量提供可靠的方法，本研究建立RP-HPLC同時測定苦木中2類生物堿（β-咔巴啉型生物堿，包括苦木堿L，苦木堿B；鐵屎米-6-酮型生物堿，包括苦木堿F，苦木堿D）及黃酮類（高麗槐素）含量，并進行多批次樣品中上述成分含量測定，以期為苦木藥材及其制劑的質量控制標準的再提高提供可資借鑒的基礎研究資料。

　　1材料

　　大連依利特P230高效液相色譜儀，配置紫外檢測器及EC2000色譜工作站（大連伊利特分析儀器有限公司）；AT-330色譜柱恒溫箱（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；Sartorius電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）。液相用乙腈為色譜純（美國Honeywell），水為超純水，其他試劑均為國產分析純（汕頭市光華化學廠有限公司）。

　　苦木堿L（1-hydroxymethyl-β-carboline，1），苦木堿B（1-methoxicabony-β-carboline，2），苦木堿F（4-methoxy-5-hydroxy-canthin-6-one，3），苦木堿D（4，5-dimethoxy-canthin-6-one，4），高麗槐素（maackiain，5）均為自制，經光譜學鑒定結構，色譜法檢測其純度均為98%以上。

　　苦木測試樣品共10批，經廣州中醫藥大學藥用植物學教研室潘超美教授鑒定為苦木科苦樹屬植物苦木P.quassioides的干燥枝和葉，憑證標本現保存于廣州中醫藥大學臨床藥理研究所。

　　2方法與結果

　　2.1色譜條件及系統適應性KromasilC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～22min，18%～25%A；22～30min，25%～40%A；30～60min，40%～45%A）；流速1.0mL・min-1；檢測波長254nm。對照品和樣品進樣量均為15μL，色譜圖見圖1。理論塔板數苦木堿L和B不低于8000，苦木堿F和苦木堿D不低于1萬，高麗槐素不低于5000。

　　2.2對照品溶液的制備精密稱取對照品1～5各適量，用甲醇充分溶解并定容，即得混合對照品儲備液，其中1～5的質量濃度分別為88.8，46.0，145.2，31.2，98.0mg・L-1。

　　2.3苦木供試品溶液的制備取干燥至恒重的苦木粉末約1.0g，精密稱定，加95%乙醇50mL，超聲提取2次，每次15min，提取液過濾，濾液減壓回收溶劑，殘渣用甲醇溶解并定容至25mL，搖勻，進樣前過0.45μm微孔濾膜。

　　2.4線性關系考察分別精密吸取混合對照品溶液0.1，1，5，10，15，20μL，進樣測定，以峰面積積分值（Y）對進樣質量（X）進行線性回歸，得回歸方程，結果見表1。

　　2.5精密度試驗精密吸取混合對照品溶液連續進樣5次，5個目標成分的峰面積RSD（n=5）在0.7%～1.2%，表明儀器精密度良好。

　　2.6穩定性試驗精密吸取苦木供試品溶液，分別于0，2，4，8，18，24h依次進樣，5個成分峰面積的RSD（n=8）在1.8%～2.8%，表明供試品在24h內穩定。

　　2.7重復性試驗取同一批次樣品6份，制備供試品溶液，測定5個化合物的含量，RSD（n=6）在1.6%～2.3%，表明該方法重復性良好。

　　2.8加樣回收率稱取已知含量的同一批樣品分別加入5個對照品適量，制備供試品溶液，進樣測定，見表2。

　　2.9樣品測定取10批次苦木樣品，制備供試品溶液，進樣測定，每批樣品平行制備3份，每份進樣3次，見表3。3討論

　　3.1色譜條件優選比較了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1%冰醋酸，乙腈-0.1%三氯乙酸，乙腈-0.1%磷酸等溶劑系統，以乙腈-0.1%磷酸溶液進行梯度洗脫時，各待測成分的分離度好。

　　3.2供試品溶液制備方法的優選以從苦木中分離得到的4個生物堿及1個黃酮成分含量為指標，比較了不同提取方法（超聲波萃取，熱回流，索式提取法），不同提取溶媒種類（95%，80%，70%，50%乙醇），不同提取溶媒用量（10，20，30，50，60，80倍量），提取時間（15，30，40，60min），提取次數（1，2，3次），確定了2.3所述供試品制備方法。

　　3.3苦木藥材的質量評價迄今為止，苦木藥材質量評價尚缺乏有效的方法，2010年版《中國藥典》苦木質量標準無專屬成分含量測定及限度，有學者采用HPLC測定苦木中鐵屎米-6-酮型生物堿的含量，但未見β-咔巴啉型及其他成分含量測定的報道。本文采用RP-HPLC同時測定10批苦木樣品中4個生物堿及1個二氫異黃酮的含量，結果5個指標成分的含量范圍分別為0.20～0.34mg・g-1（1），0.26～0.45mg・g-1（2），3.31～3.86mg・g-1（3），0.18～0.52mg・g-1（4）和2.64～3.98mg・g-1（5）。其中2個β-咔巴啉型生物堿的總量平均值為0.61mg・g-1，2個鐵屎米-6-酮型生物堿的總量平均值為3.98mg・g-1。不同產地及采收時間的樣品含量差異較小，初步推斷該藥材質量較穩定，尚需大樣本樣品驗證。

　　根據本實驗樣品測定結果建議苦木藥材的質量控制標準中增加鐵屎米-6-酮型生物堿即苦木堿F的含量測定并制定其含量限度；增加β-咔巴啉型生物堿及二氫異黃酮即高麗槐素的鑒別項。

　　[參考文獻]

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　　Simultaneousdeterminationof4alkaloidsandaflavonoidin