【摘 要】目的：研究雄鼠睪丸Clock基因沉默后，小鼠體外受精的變化及機(jī)制。方法：通過在ICR小鼠睪丸內(nèi)注射Clock干擾質(zhì)粒(實(shí)驗(yàn)組)和HK陰性對照質(zhì)粒(對照組)，注射18天后收集雄鼠精子，計(jì)數(shù)精子濃度，前向運(yùn)動(dòng)精子百分率和精子總活率。再將孵育好的精子加入卵培養(yǎng)皿中，分別觀察卵丘顆粒細(xì)胞驅(qū)散情況及卵裂情況，計(jì)算受精率、囊胚生成百分率和胚胎孵化率。結(jié)果：睪丸Clock基因沉默后，小鼠精子活動(dòng)率及前向運(yùn)動(dòng)率較對照組降低(p<0.05)，實(shí)驗(yàn)組精子驅(qū)散卵丘顆粒細(xì)胞能力的時(shí)間延長(p<0.001)。結(jié)論：睪丸clock基因可影響精子驅(qū)散卵丘顆粒細(xì)胞的能力，該機(jī)制在Clock基因影響小鼠生殖的過程中的作用有待進(jìn)一步研究。

　　【關(guān)鍵詞】醫(yī)師論文發(fā)表,Clock基因,精子,體外受精,前向運(yùn)動(dòng),受精率

　　0 引言

　　近日節(jié)律在生物的生殖和發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[1]。Clock基因是近日節(jié)律系統(tǒng)的核心成分，它在哺乳動(dòng)物的生殖器官有表達(dá)，如子宮[2]，輸卵管 [3]和睪丸[4]等。研究發(fā)現(xiàn)Clock基因突變可引起動(dòng)物生殖能力變化，如L.M.Beaver等發(fā)現(xiàn)果蠅睪丸和精囊中的精子數(shù)量下降，雄性生育能力降低[5]。通過前期研究，我們發(fā)現(xiàn)干擾睪丸Clock基因的表達(dá)引起小鼠胎仔數(shù)下降[6]，小鼠的生殖能力降低[7]。但Clock基因引起其生殖能力下降這一現(xiàn)象的機(jī)制一直未明了，本研究通過向小鼠睪丸注射Clock干擾質(zhì)粒沉默Clock基因，觀察精子運(yùn)動(dòng)和體外受精的變化，以進(jìn)一步探究Clock 基因影響小鼠生殖的機(jī)制[8]。

　　1 材料和試劑

　　1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

　　實(shí)驗(yàn)中雄性ICR小鼠8-10周，雌性ICR 小鼠4-6周，均飼養(yǎng)于光暗各12h的循環(huán)箱內(nèi)，自由進(jìn)食和飲水;將雄性小鼠20只隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組2組，每組10只，實(shí)驗(yàn)組在睪丸內(nèi)注射 Clock干擾質(zhì)粒，對照組在睪丸內(nèi)注射HK陰性質(zhì)粒。雌鼠10只，每組5只(雌雄比，雌：雄=1：2)。雌雄分開飼養(yǎng)。

　　1.2 試劑

　　質(zhì)粒：Clock干擾質(zhì)粒(武漢晶賽公司);HK陰性對照質(zhì)粒(武漢晶賽公司);OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒;孕馬血清促性腺激素(PMSG);絨毛膜促性腺激素(HCG);HTF培養(yǎng)液;HEPES-HTF培養(yǎng)液;卵裂培養(yǎng)液;囊胚培養(yǎng)液;血清蛋白代用品(SPS);動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑In vivo-jetPEITM(Poly Plus)。

　　2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

　　2.1 實(shí)驗(yàn)處理

　　雄性小鼠乙醚麻醉。實(shí)驗(yàn)組：用微量注射器將20μlClock干擾質(zhì)粒注射入小鼠的雙側(cè)睪丸里。對照組：用微量注射器將20μlHK陰性對照質(zhì)粒注射入小鼠的雙側(cè)睪丸里。注射質(zhì)粒18天后，手術(shù)法收集精子并孵育精子。向雌鼠體內(nèi)腹腔注射PMSG 10IU/只，同等條件下培養(yǎng)觀察兩天之后，再次向雌鼠體內(nèi)腹腔注射HCG 10IU/只，培養(yǎng)并觀察15-16h，用頸脫臼法處死小鼠。配置卵培養(yǎng)液待用。再將孵育好的精子濃度約為1×106/ml精子加入卵培養(yǎng)皿中進(jìn)行體外受精及胚胎發(fā)育的觀察。

　　2.2 結(jié)果觀察

　　我們在注射質(zhì)粒后的18天，將收集到雄鼠精子統(tǒng)計(jì)分析并計(jì)算其精子濃度。精子因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)方式的不同，可分為三個(gè)等級：前向運(yùn)動(dòng)(A級：快速前向直線運(yùn)動(dòng)和B級：直線運(yùn)動(dòng))、非前向運(yùn)動(dòng)(C級：曲線運(yùn)動(dòng)和D級：原地打轉(zhuǎn))、不動(dòng)。針對不同視野的200個(gè)精子按照運(yùn)動(dòng)方式進(jìn)行分級，計(jì)算前向運(yùn)動(dòng)精子百分率和精子活動(dòng)率，以此來觀察和分析精子的活動(dòng)度的變化。前向運(yùn)動(dòng)精子百分率=前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù) /200×100%;精子活動(dòng)率=(前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)+非前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù))/200×100%。

　　通過計(jì)算受精率、囊胚形成率和胚胎孵化率來觀察ICR小鼠體外受精及胚胎發(fā)育的情況。按如下方法進(jìn)行計(jì)算：受精率=卵裂胚數(shù)/卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體數(shù)×100%;囊胚形成率=囊胚數(shù)/卵裂胚數(shù)×100%;胚胎孵化率=孵出胚胎數(shù)/囊胚總數(shù)×100%。

　　2.3 統(tǒng)計(jì)分析

　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)，率的比較采用Χ2檢驗(yàn)。本研究數(shù)據(jù)均采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

　　3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

　　3.1 精子活動(dòng)度

　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1，實(shí)驗(yàn)組和對照組的精子濃度分別為(16.77±7.65)×106/ml、(18.76±10.37)×106/ml，兩組精子濃度無明顯差異(P>0.05)。

　　表1 干擾小鼠睪丸Clock基因后精子的活動(dòng)度

　　注：*與對照組相比，p<0.05.

　　實(shí)驗(yàn)組前向運(yùn)動(dòng)精子百分率為(36.09±7.54)%，精子活動(dòng)率為(62.83±8.20)%;對照組前向運(yùn)動(dòng)精子百分率為(42.00±8.02)%，精子活動(dòng)率為(69.44±9.47)%，兩組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，實(shí)驗(yàn)組前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、精子活動(dòng)率下降。

　　3.2 體外受精及早期胚胎發(fā)育

　　觀察獲能精子與成熟卵母細(xì)胞共孵育情況發(fā)現(xiàn)，與實(shí)驗(yàn)組精子共孵育的卵母細(xì)胞外卵丘顆粒細(xì)胞被驅(qū)散速度明顯延遲。在共孵育5分鐘時(shí)，對照組中所有卵母細(xì)胞外卵丘顆粒細(xì)胞均被驅(qū)散，而實(shí)驗(yàn)組中所有卵母細(xì)胞外卵丘顆粒細(xì)胞并未被驅(qū)散(表2)。

　　表2 體外受精后卵母細(xì)胞外卵丘顆粒細(xì)胞驅(qū)散情況

　　*：Χ2檢驗(yàn)，p<0.001.

　　體外受精后形成的2-細(xì)胞胚胎，4-細(xì)胞胚胎。實(shí)驗(yàn)組的受精率為(63.66±12.60)%，對照組的受精率為(78.83±14.38)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，表明Clock基因沉默后，受精率降低。受精后第3天更換新的囊胚培養(yǎng)液培養(yǎng)至受精后第6天，觀察記錄囊胚的形成和孵化情況。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，受精后，實(shí)驗(yàn)組囊胚的形成率、孵化率和對照組相比，均無明顯差異。 　　表3 干擾小鼠睪丸Clock基因后其精子體外受精及

　　早期胚胎發(fā)育的情況

　　注：*與對照組相比，p<0.05

　　4 討論

　　Clock基因是近日節(jié)律的核心基因，在CLOCK蛋白與Bmal1形成的異二聚體中發(fā)揮重要作用。我們用RNAi干擾CLOCK蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)小鼠的生殖能力明顯受到影響。本文進(jìn)一步觀察Clock基因干擾后，雄鼠精子運(yùn)動(dòng)能力和授精能力的變化。

　　精子運(yùn)動(dòng)能力的強(qiáng)弱與受精密切相關(guān)，只有正常(下轉(zhuǎn)第87頁)(上接第8頁)前向運(yùn)動(dòng)的精子才可能抵達(dá)輸卵管壺腹部與卵子結(jié)合形成受精卵。本研究發(fā)現(xiàn) Clock基因沉默后，精子前向運(yùn)動(dòng)的百分率降低，在體外受精過程中，精子驅(qū)散顆粒細(xì)胞能力有所降低，提示實(shí)驗(yàn)組很可能影響了精子頂體反應(yīng)的酶，使得其受精率降低。在精子形成過程中，發(fā)育中的頂體發(fā)現(xiàn)有Clock基因的表達(dá)，用RNAi干擾Clock基因的表達(dá)，小鼠睪丸CLOCK蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，頂體酶活性明顯降低。綜合上述研究和本研究的結(jié)果，可以推測Clock基因通過影響頂體酶的活性，進(jìn)一步影響精子驅(qū)散卵丘顆粒細(xì)胞的能力。體外受精成功后，早期胚胎形成發(fā)育過程中，囊胚的形成率和胚胎的孵化率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但胎仔數(shù)卻明顯下降。因此，睪丸Clock基因干擾可引起精子前向運(yùn)動(dòng)異常和驅(qū)散卵丘時(shí)間延長，影響了雄性小鼠的生殖功能，但其具體機(jī)制以及對胚胎發(fā)育的影響尚需進(jìn)一步的研究。

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