【摘要】 目的：研究殼聚糖-磷酸三鈣復合材料(CTCP)支架的制備新方法及其制品性能。方法：采用重結晶-凍干法制備支架，通過大體觀察、pH值、孔隙率及孔隙直徑測定、細胞復合培養來研究支架性能，直接凍干法支架作為對照。結果：重結晶法最優組較對照組在孔隙率上比較差異有統計學意義(P<0.05)。孔隙直徑也更理想，以100～300 μm為主;細胞能進入材料的孔隙并生長良好。結論：重結晶法制備聚糖-磷酸三鈣支架有更好的孔隙質量;較高的重結晶溫度和速率可能是提高孔隙質量的有利因素。

　　【關鍵詞】 醫學論文,殼聚糖,磷酸三鈣,支架,組織工程,重結晶法

　　Study of Recrystallization Method Using in Chitosan/Tricalcium Phosphate Scaffold Freeze Drying and Performance Assessment of the Products/MO Bi-fan，MO Bi-wen.//Chinese and Foreign Medical Research，2014，12(20)：3-5

　　【Abstract】 Objective： To explore the new method of chitosan/tricalcium phosphate(CTCP) scaffold preparation， and the scaffold’s performance assessment. Method： CTCP scaffolds were prepared by recrystallization method and ordinary mode， which were investigated by macroscopic observation， pH value， porosity， pore diameter and cell co-culture.Result： The best experimental group present significantly difference between control group in porosity(P<0.05).Which had better pore diameter in 100-300 μm mainly and cell co-cultured present well-growing through the pore.Conclusion： CTCP scaffold has better pore quality， higher recrystal temperature and it’s rate could be the favorable factor to improve the quality of scaffold pore.

　　【Key words】 Chitosan; Tricalcium phosphate; Scaffold; Tissue engineering; Recrystallization

　　First-author’s address： Guilin Medical College Affiliated Hospital， Guilin 541001，China

　　在醫療實踐中組織、器官的缺損是很常見的癥狀。組織工程學是近年來發展起來的一門新興邊緣學科，其基本方法是將生長因子/活細胞種植于具有良好生物相容性和降解度的生物材料支架(scaffold)上，培養后將生長因子/活細胞生物材料復合體植入機體病損部位以形成新的具有其原來功能和形態的組織和器官，達到修復創傷和重建功能的目的，其中生物材料支架是組織工程的基本要素[1]。通過學習冷凍物理學的相關原理，本研究在醫學領域創新性地使用冷凍-重結晶的方法處理基材溶液以獲得更理想的冰晶結構，然后通過凍干法制備出新型的殼聚糖-磷酸三鈣復合材料(chitosan/tricalcium phosphate，CTCP)支架，并測試其組織工程相關性能，為組織工程材料進展提供有益的實驗依據。

　　1 資料與方法

　　1.1 一般資料

　　殼聚糖(山東金湖甲殼制品公司，批號20110302，脫乙酰度96.7%，灰分0.55%);磷酸三鈣(廣東臺山市眾城化工公司，分析純);乙酸(廣東西隴化工公司，分析純);DMEM/H(Hyclone，美國);胎牛血清(Gibco，美國);胰蛋白酶(Gibco，美國);FGF- 2(ProSpec，以色列);pH廣泛試紙(杭州特種紙業公司);石膏振蕩器(安華齒科公司，中國);120目分樣篩(振興篩具廠，中國，孔徑120 μm);聚四氟乙烯培養皿(9 cm直徑);真空攪拌器(保定蘭格自動化公司，HB8135A，配真空泵);生物冰箱(美菱公司，中國);冷凍干燥機(CHRIST ALPHA 1-2，德國);體視顯微鏡(Olympus SZX-10，日本，倍數6.3～63);高速離心機(Avanti J-E，貝克曼公司，美國);倒置相顯微鏡系統(Olympus CKX41，日本)。

　　1.2 原料的處理

　　磷酸三鈣研磨后輔以石膏振蕩器過篩，得到直徑小于120 μm的粉粒;乙酸與蒸餾水配制成5%溶液。將2.5 g殼聚糖粉末與2.5 g磷酸三鈣粉末混勻，加入裝有5%醋酸溶液95 ml的燒杯中。燒杯放進真空攪拌器，抽真空，期間調節轉速達到混勻粉液、去除氣泡的目的。20 min左右形成均勻的膠狀混懸液。將該液分裝于培養皿，厚度4 mm左右。放入-24 ℃的冰箱冷凍層內預凍成型。

　　1.3 重結晶處理 　　蓋上培養皿，分3組進行重結晶，同時冷干機開始預熱：Ⅰ組置于室溫23 ℃ 5 min;Ⅱ組置于冰箱11 ℃ 15 min;Ⅲ組置于冰箱0 ℃ 30 min;然后移入冷干機擱板上，密封干燥箱(筒)，開啟凍干程序，試樣完成最后的重結晶再凍結過程。Ⅳ組不進行重結晶，直接進入凍干作為對照組。

　　1.4 凍干

　　冷干機繼續運行，按程序凍干24 h，之后干燥，得到固體試樣。

　　1.5 檢測方法

　　1.5.1 大體觀察 以手術刀片切開試樣，肉眼觀察試樣表面及內部的孔隙分布情況。

　　1.5.2 pH值測定 制備72 h后的試樣，用蒸餾水濕潤pH廣泛試紙，貼附于試樣表面2 s后取下，對照色帶。每個試樣正面和底面做多處測試。

　　1.5.3 孔隙率的測定 用乙醇替代法測定材料孔隙率。每組2個試樣各剪成1/4圓面積得到每組8個樣品。將每個樣品置于一定體積的(V1)乙醇中，用凍干機常溫抽真空至15 m bar脫氣泡后，材料和乙醇總體積記為V2，再將材料移出，剩余乙醇體積記為V3，則材料孔隙率p=V1-V3/V2-V3;計算各組平均孔隙率;對重結晶孔隙率最高組(Ⅰ組)與Ⅳ組的組間差異進行統計學分析。

　　1.5.4 孔隙直徑的測定 將Ⅰ、Ⅳ組試樣用體視顯微鏡(olympus szx10)以6.3倍率觀察、測量孔隙直徑。均勻選取多點。

　　1.5.5 細胞復合支架材料觀察 將Ⅰ組成品試樣剪成2 mm×

　　5 mm×1 mm大小，置于培養皿中，用(2～3)×10-7 m波長紫外線消毒，距離15 cm，照射0.5 h。滅菌PBC每次浸泡10 min、以滴管基本吸干，換液3次后備用。細胞的收集和接種：用0.25%胰蛋白酶消化雞胚成纖維細胞，1000 r/min離心5 min，收集細胞，調整細胞濃度至5×106 個/ml。將細胞直接加入已經處理好的材料中，在37 ℃濕化空氣孵箱中培養(DMEM，雙抗，10 ng/ml FGF-2，10%胎牛血清)，隔日換液。倒置相差顯微鏡觀察細胞生長及與生物材料粘附情況。

　　2 結果

　　2.1 大體觀

　　-24 ℃預凍成型時，冰凍物肉眼可見極細小冰晶密布;重結晶后三組都出現更粗大的梭形冰晶，呈組狀交織排列;冰晶大小和分布面積，Ⅰ組>Ⅱ組>Ⅲ 組。試樣為圓餅形，黃白色，海綿狀多孔隙結構，孔隙呈組狀交織排列及無序排列，底面見磷酸三鈣粉末沉積現象。試樣具有一定強度。干燥時脆性大，吸濕后呈現一定的韌性從而能被裁剪成特定形狀。肉眼看試樣的孔隙大小和分布面積，Ⅰ組>Ⅱ組>Ⅲ組>Ⅳ組。

　　2.2 pH值

　　試樣各處pH值均勻，均為8，呈弱堿性。

　　2.3 孔隙率

　　Ⅰ組孔隙率93.3%，Ⅱ組74.6%，Ⅲ組68.1%，Ⅳ組47.6%。Ⅰ組(最優組)、Ⅳ組(對照組)間比較差異有統計學意義(P<0.05)。

　　2.4 孔隙直徑

　　孔隙直徑變動較大。Ⅰ組在該倍率下以100～300 μm的孔隙為主，見圖1;Ⅳ組多數孔徑低于100 μm。

　　圖1 Ⅰ組支架孔隙6.3倍圖

　　2.5 細胞復合培養

　　鏡下觀察見部分細胞生長進入材料孔隙內細胞形態大部分亦呈梭形且簇集，生長情況良好，詳見圖2。

　　圖2 材料與細胞復合培養100倍圖

　　3 討論

　　近年來應用組織工程修復組織缺損成為研究熱點。其中使用生物材料制備的支架是一個關鍵環節[2]。殼聚糖是由一種具有無毒、抑菌易降解等優秀性能的生物材料，磷酸三鈣與之復合制作支架，能提高支架的強度、韌性及成骨性能[3-4]。殼聚糖多是由蝦、蟹等類水生動物的甲殼提取的甲殼素脫乙酰化而得到的，溶于醋酸等有機溶劑形成凝膠，易于塑形，用凍干法脫水可制備出三維多孔性結構支架。它作為支架材料的優點有：無毒，具有優良的生物相容性和可降解性，能夠促進具有成骨潛能細胞的分化并有利于骨形成，可促進多種組織細胞的黏附和增殖，是理想的生物材料[5-7]。值得一提的是殼聚糖具有抑菌性，有實驗表明，以金黃色葡萄球菌誘導家兔使其發生骨髓炎，殼聚糖可降低其感染率[8]。磷酸三鈣具有良好的生物相容性和骨引導活性，機械性能好，其降解產物呈堿性，而弱堿性環境利于成骨細胞帖附、增殖，從而降低殼聚糖降解產生的酸性[9]。此外磷酸三鈣具有良好的可降解性，這是組織工程材料的一個重要要求[10]。某些生物相容性好的材料如羥基磷灰石(HA)，由于不能降解，并不符合組織工程支架的要求[11-13]。

　　具有合適的微觀孔結構是骨組織工程用多孔支架能否發揮最優成骨效能的關鍵。微觀孔徑結構主要指孔徑大小、孔隙率、孔間連通程度、連通孔道的扭曲程度和支架表面積。支架應具有盡可能高的孔隙率才能滿足細胞和新生毛細血管的生長進入，實現營養輸運和廢物排泄，最終完成新生組織和器官的完成。對于孔徑多少合適一直存在爭議：一般認為孔徑在100 μm以上才能使成骨細胞在孔洞內游移，以孔徑在200 μm以上有較優的成骨效能[14]。Jones等[15]報告，以孔徑大于100 μm的網孔生物活性玻璃作為組織工程支架取得滿意結果。馬寧等[16]制備孔徑約100～400 μm的殼聚糖-聚磷酸三鈣復合材料復合培養牙周膜細胞效果良好。

　　凍干法制備支架其孔徑大小取決于預凍是形成的冰晶大小，通常可通過調整冷凍速率來控制，冰晶的生長方向可通過定向結晶控制[17]。但精密可控降溫冷凍設備并不普及，且有昂貴、耗時的缺陷。重結晶是指在加熱時由于小冰晶的分子向大冰晶遷移，而使固相系統中晶體大小的分布漸漸發生變化的過程。在該過程中，小于臨界尺寸的冰晶變小直至消失，大于臨界尺寸的冰晶逐漸長大[18]。研究證實退火過程中的相行為和重結晶還可以減小由于成核溫度差異造成的冰晶尺寸差異及干燥速率的不均勻性，提高干燥效率和藥品均勻性[17]。作者用實驗室通用冰箱進行樣品溶液的全域冷凍，然后借鑒退火原理，通過升溫將預凍好的玻璃態樣品重結晶，達到促成更完全結晶、改變冰晶形態和大小分布的目的，結果證實重結晶孔隙率最優組與未重結晶組存在顯著差異，孔隙直徑也更理想[19]。 　　本研究中試樣pH為8，呈弱堿性，將有利于利于成骨細胞帖附、增殖。Ⅰ組試樣孔隙直徑以100～300 μm為主，孔洞之間互相通連形成良好的三維多孔網狀結構，孔隙率93.3%，達到較理想組織支架的效果。細胞復合培養及后續的動物實驗也證實了這一點。試樣的孔隙大小、分布面積和孔隙率，Ⅰ組>Ⅱ組>Ⅲ組，這可能表明較高的重結晶溫度和速率導致更大更多的結晶生成，這與Kramer等[20] 的研究結論是相似的。關于各類制劑的退火(重結晶)溫度、持續時間、結晶大小、結晶率以及溶液濃度等的多因素數學模型很復雜，目前國內外都未見建立，這也是本研究未解決的問題，有待后續進一步研究。

　　參考文獻

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