[摘要] 目的 研究鈣敏感受體(CaSR)和增殖細胞核抗原(PCNA)在非小細胞肺癌(NSCLC)中的表達及其意義。方法 收集齊齊哈爾市第一醫(yī)院胸外科2012～2013年手術(shù)標(biāo)本，采用免疫組化法檢測112例NSCLC組織及33例NSCLC癌旁組織中CaSR、PCNA的表達情況。 結(jié)果 CaSR和PCNA在NSCLC組織中的表達(86.36%、84.82%)明顯高于癌旁組織(15.15%、24.24%)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05)。CaSR與PCNA的表達水平與TNM分期、腫瘤大小、腫瘤分化及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P < 0.05或P < 0.01)，與年齡、性別和腫瘤分型無關(guān)(P > 0.05)。在NSCLC組織中CaSR與PCNA的表達呈正相關(guān)(r = 0.401，P < 0.01)。 結(jié)論 CaSR和PCNA在NSCLC組織中的表達異常增高，并且具有較好的相關(guān)性，CaSR可能參與肺癌的增殖與分化，促進肺癌的發(fā)生發(fā)展。

　　[關(guān)鍵詞] 臨床醫(yī)學(xué)論文,非小細胞肺癌,鈣敏感受體,增殖細胞核抗原,免疫組織化學(xué)

　　Expression and clinicopathologic significance of calcium sensing receptor in non-small cell lung cancer

　　CUI Kailin1 WU Bingxia1 LI Bo1 WU Shuqin2 MIAO Hongzhi3 LI Guangwei1

　　1.Department of Pathophysiology， Qiaihar Medical University， Heilongjiang Province， Qiqihar 161006， China; 2.Department of Physiology， Qiaihar Medical University， Heilongjiang Province， Qiqihar 161006， China; 3.Department of Thoracic Surgery， the First Hospital of Qiqihar， Heilongjiang Province， Qiqihar 161005， China

　　[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significance of calcium sensing receptor (CaSR) and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods The surgical samples in the Department of Thoracic Surgery， the First Hospital of Qiqihar from 2012 to 2013 were collected. The expression of CaSR and PCNA were detected in 112 paraffin-embedded NSCLC tissues and 33 adjacent normal lung tissues (control group) using immunohistochemistry. Results The expression levels of CaSR and PCNA (86.36%， 84.82%) were distinctly higher in NSCLC than those in the control group (15.15%， 24.24%)， the differences were statistically significant (P < 0.05). The expression of CaSR and PCNA in NSCLC were significantly correlated with tumor differentiation， TNM stage， tumor size and lymph node metastasis (P < 0.05 or P < 0.01) and not correlated with age， gender， tumor types (P > 0.05). The expression of CaSR was positive correlated with PCNA in NSCLC (r = 0.401， P < 0.01). Conclusion CaSR expression is correlated with PCNA expression， CaSR has an important function in NSCLC， and promotes the occurrence and development of NSCLC.

　　[Key words] Non-small cell lung cancer; CaSR; PCNA; Immunohistochemistry

　　近年肺癌已成為我國第一大癌癥[1]，發(fā)病率和病死率逐年上升，因此肺癌的診治已成為我國臨床醫(yī)生必須面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在肺癌發(fā)生中起重要作用，但其具體機制不甚清楚。鈣敏感受體(calcium sensing receptor，CaSR)是新進發(fā)現(xiàn)的一種G蛋白偶聯(lián)受體，由Brown等[2]于1993年首先從牛的甲狀旁腺中克隆出來。國外多項研究證明，CaSR在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。細胞外鈣離子可以通過CaSR促進乳腺細胞的增殖和分化，進一步導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生[3-4]。然而，肺癌組織中是否有CaSR蛋白的表達，其活化與肺癌發(fā)生及臨床病理關(guān)系如何，迄今未見報道。本課題將對上述問題展開研究。

　　現(xiàn)報道如下：

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　收集齊齊哈爾市第一醫(yī)院(以下簡稱“我院”)胸外科2012～2013年非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)手術(shù)標(biāo)本112例，包括對應(yīng)的癌旁組織33例患者年齡32～76歲，平均(55.06±15.13)歲，男80例，女32例。33例癌旁組織患者的年齡35～72歲，平均(53.82±16.26)歲，男23例，女10例，其年齡、性別與NSCLC患者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P > 0.05)，具有可比性。112例NSCLC組織中，腺癌36例，鱗癌44例，腺鱗癌32例;按照國際抗癌聯(lián)盟(UICC)2009年修訂的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期38例，Ⅱ期40例，Ⅲ期34例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移62例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例;高中分化74例，低分化38例�；颊咝g(shù)前均未經(jīng)化療，所有標(biāo)本均經(jīng)過資深臨床病理醫(yī)生診斷，本研究經(jīng)我院倫理委員會同意，取得患者或家屬的同意并簽署知情同意書。

　　1.2 主要試劑

　　兔抗CaSR多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，鼠抗增殖細胞核抗原(PCNA)多克隆抗體購自于武漢博士德生物技術(shù)有限公司，免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

　　1.3 實驗方法

　　組織標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，厚度約4 μm。采用免疫組織化學(xué)SP二步法。切片經(jīng)3%過氧化氫去離子水孵育5 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗;滴加一抗，37℃孵育1 h，PBS沖洗;滴加通用型IgG抗體-HRP多聚體，37℃孵育15 min，PBS沖洗;應(yīng)用二氨基聯(lián)苯胺溶液顯色，顯微鏡下控制，去離子水沖洗多余未結(jié)合的顯色液;水洗、蘇木精復(fù)染、1%鹽酸酒精分化;返藍，脫水，透明封片。顯微鏡下觀察結(jié)果。

　　1.4 結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

　　CaSR表達主要在胞漿及胞膜，呈棕黃色顆粒。PCNA表達主要在胞核，為棕黃色顆粒。400倍視野下，每例隨機選取不重復(fù)5個視野，每個視野計數(shù)100個細胞。然后按陽性細胞占全部細胞的百分率分為：無著色為(-)，陽性細胞數(shù)≤25%為(+)，>25%～75%為(++)，>75%為(+++);(-)～(+)定義為低表達，(++)～(+++)定義為高表達[5]。

　　1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

　　采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，采用Spearman等級相關(guān)性檢驗進行相關(guān)性分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

　　2 結(jié)果

　　2.1 鈣敏感受體和增殖細胞核抗原在非小細胞肺癌及癌旁組織中的表達

　　CaSR表達主要在胞漿及胞膜，其在NSCLC和癌旁組織中的陽性表達率分別為86.36%(97/112)、15.15%(5/33)。PCNA表達在胞核，陽性表達率分別為84.82%(95/112)、24.24%(8/33)。二者在NSCLC組織中的表達顯著高于癌旁組織(P < 0.05)，且在癌旁組織中的陽性表達均為低表達。見圖1、2(封四)。

　　2.2 鈣敏感受體和增殖細胞核抗原表達與臨床病理特征的關(guān)系

　　NSCLC組織中CaSR蛋白的陽性表達率與性別、年齡及病理類型均無相關(guān)性(P > 0.05)，但是CaSR蛋白與PCNA的陽性表達率與腫瘤大小、TNM分期、腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05或P < 0.01)。見表1。

　　2.3 鈣敏感受體和增殖細胞核抗原在非小細胞肺癌中表達的相關(guān)性

　　經(jīng)Spearman等級相關(guān)性分析結(jié)果顯示，NSCLC組織中CaSR和PCNA的表達且呈正相關(guān)(r = 0.401，P < 0.01)。見表2。

　　3 討論

　　惡性腫瘤是人類健康的第一殺手，肺癌在惡性腫瘤中所占位次由原來的第4位上升至第1位[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測，到2015年我國將成為世界第一肺癌大國，因此肺癌的診治已成為我國臨床醫(yī)生必須面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。細胞內(nèi)鈣離子是重要的第二信使，能夠激活不同的信號通路，參與許多重要生命活動的調(diào)節(jié)[6]。腫瘤發(fā)生發(fā)展過程常伴隨鈣離子信號的異常，但其發(fā)生機制不甚清楚。因此，了解肺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，可以顯著改善患者預(yù)后，提高患者生存質(zhì)量，為肺癌治療尋找新靶點提供依據(jù)。

　　CaSR是G蛋白偶聯(lián)受體C家族的成員，其功能主要是維持Ca2+和其他金屬離子穩(wěn)態(tài)，同時在細胞分泌、增殖、分化、趨化、凋亡、基因表達、維持膜電位、離子通道開關(guān)、衰老等過程中亦發(fā)揮重要作用[7-11]。越來越多的研究表明，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中CaSR發(fā)揮著重要作用[12-14]。CaSR是影響乳腺癌預(yù)后的獨立的風(fēng)險因子[15]。CaSR基因敲除，則導(dǎo)致體外細胞增殖和體內(nèi)骨轉(zhuǎn)移的進程減慢[16]。然而，在肺癌組織中是否有CaSR蛋白的表達，以及CaSR與肺癌的發(fā)生發(fā)展之間是否有關(guān)，目前國內(nèi)外未見報道。本實驗通過免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察了CaSR在NSCLC組織中的表達。結(jié)果顯示，CaSR在癌旁組織中呈陰性或低表達，而在大部分NSCLC組織中表達顯著上調(diào)，其表達強度隨腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況而不同，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05或P < 0.01)。上述結(jié)果提示，NSCLC中CaSR的表達可能與腫瘤細胞的增殖及侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。

　　Osvaldo等[17]研究證實活化的CaSR可以抑制正常結(jié)腸上皮細胞和結(jié)腸癌早期上皮細胞的增殖。同時，在其他實驗中觀察到CaSR活化能夠促進肺動脈平滑肌細胞增殖[18-19]，因此，本研究推測CaSR活化促進肺癌細胞增殖。為了觀察NSCLC中CaSR活化與肺癌細胞增殖的關(guān)系，本實驗還檢測了PCNA蛋白在NSCLC中的表達。PCNA是公認(rèn)的細胞增殖的標(biāo)志物。其表達增加，代表著細胞增殖活躍。本研究觀察到：在癌旁組織中PCNA呈陰性或低表達，在大部分NSCLC組織中表達顯著增高，其表達強度隨腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況而不同，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05)。Spearman等級相關(guān)性分析顯示：NSCLC組織中CaSR和PCNA的表達呈正相關(guān)(r = 0.401，P < 0.01)。進一步驗證了筆者的假設(shè)即CaSR活化促進肺癌細胞增殖。 　　本實驗只在臨床肺癌標(biāo)本中初步觀察到此現(xiàn)象，關(guān)于CaSR活化后通過什么信號途徑和機制引起肺癌細胞增殖，及其與肺癌患者預(yù)后有什么關(guān)系，在肺癌患者的臨床治療中有何作用，有待于深入的研究。

　　[參考文獻]

　　[1] Parkin DM，Bray F，F(xiàn)erlay J，et al. Global cancer statistics [J]. 2002，CA Cancer J Clin，2005，55(2)：74-108.

　　[2] Brown EM，Gamba G，Riccasrdi D，et al. Cloning and characterization of an extracellular Ca2+-sensing receptor from bovine parathyroid [J]. Nature，1993，366(6455)：575-580.

　　[3] EL Hiani Y，Ahidouch A， Lehen，kyi V，et al. Extracellular signal-regulated Kinases 1 and 2 and TRPC1 channels are required for calcium-sensing receptor-stimulated MCF-7 breast cancer cell proliferation [J]. Cell Physiol Biochem，2009，23(4-6)：335-346.

　　[4] Huang C，Hydo LM，Liu S，et al. Activation of choline kinase by extracellular Ca2+ is Ca2+-sensing receptor， Gα12 and Rho-dependent in breast cancer cells [J]. Cellular Signalling，2009，21(12)：1894-1900.

　　[5] 韓文恒，張遜，徐美林，等.Cdc42和WAVE1在非小細胞肺癌中的表達及臨床病理意義[J].中國腫瘤臨床，2013， 23(40)：1445-1449.

　　[6] 張奇，何建行，盧文菊，等.經(jīng)典瞬時受體電位通道蛋白在人非小細胞肺癌組織中的表達[J].中國肺癌雜志，2010， 13(6)：612-616.