[摘要]研究四逆湯中甘草與其他藥味配伍后藥效成分甘草苷、甘草酸、甘草素、異甘草素含量的變化。以甘草單煎液、甘草附子合煎液、甘草干姜合煎液、四逆湯為供試品，采用HPLC測定甘草中4種藥效成分的含量變化。結果顯示甘草配伍不同藥味之后4種藥效成分含量均降低，且4種藥效成分的含量均為甘草單煎液>甘草干姜合煎液>甘草附子合煎液>四逆湯。其中甘草苷質量濃度分別為11.18，9.89，9.67，9.17 mg・g-1;甘草酸質量濃度分別為20.76，15.58，11.30，8.52 mg・g-1;甘草素質量濃度分別為0.66，0.57，0.45，0.24 mg・g-1;異甘草素質量濃度分別為0.14，0.07，0.03，0.01 mg・g-1。因此，甘草配伍干姜后甘草中藥效成分含量明顯降低，為甘草可緩干姜之烈性提供了科學依據;甘草配伍附子后甘草中藥效成分含量大幅度降低，為甘草解附子之毒的物質基礎研究提供了科學支撐;甘草與附子、干姜共同配伍后甘草中藥效成分含量進一步降低，說明四逆湯方中3味藥相互依存相互牽制以共奏藥效，體現了四逆湯藥味之間相畏/相殺、相須/相使配伍的科學內涵。

　　[關鍵詞]醫學論文發表,四逆湯,甘草,配伍,含量變化

　　Changing rules study of effective components of Glycyrrhizae Radix et

　　Rhizoma before and after compatibilities in Sini decoction

　　PENG Wei1， JIANG Yan-ping1， FU Chao-mei1*， GAO Fei2， YANG Huan1， LIU Ge-yi1， YU Jia-li1

　　(1. Pharmacy College， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Ministry of Education Key Laboratory of

　　Standardization of Chinese Herbal Medicine， State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research，

　　Development and Utilization of Chinese Medicine Resources， Chengdu 611137， China;

　　2. Hong Kong University， Li Ka-shing Medical College; Traditional Chinese Medicine College， Hong Kong 999077， China)

　　[Abstract]The change of the effective components (liquiritin， glycyrrhizic acid， liquiritigenin， isoliquiritigenin) contents of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (GRR) before and after compatibilities in Sini decoction was studied in this paper. Taking single GRR decoction， GRR-Aconiti Lateralis Radix Praeparata (ALRP) decoction， GRR-Zingiberis Rhizoma (ZR) decoction and Sini decoction as test samples， the contents changing of the four effective components of GRR were measured by HPLC. The results showed that the contents of the four effective components of GRR in the single GRR decoction was higher than that in other samples， and the sequence was single GRR decoction>GRR-ZR decoction>GRR-ALRP decoction>Sini decoction. The contents of liquiritin were 11.18， 9.89， 9.67， 9.17 mg・g-1; the contents of glycyrrhizic acid were 20.76， 15.58， 11.30， 8.52 mg・g-1; the contents of liquiritigenin were 0.66， 0.57， 0.45， 0.24 mg・g-1; the contents of isoliquiritigenin were 0.14，0.07， 0.03， 0.01 mg・g-1. Therefore， the effective components of GRR decreased obviously after GRR compatibility with ZR providing scientific basis for GRR relieving the strong nature of ZR. The effective components of GRR decreased sharply after GRR compatibility with ALRP providing scientific support for the material foundation research of GRR reducing the toxicity of ALRP. The effective components of GRR decreased further in Sini decoction indicating that the three medicines in Sini decoction were interactional， which reflecting the scientific connotation of the mutual-restraint/mutual-detoxication， mutual-promotion/mutual-assistance compatibilities in Sini decoction. 　　[Key words]Sini decoction; Glycyrrhizae Radix et Rhizoma; compatibility; content changing

　　doi：10.4268/cjcmm20150116

　　四逆湯出自《傷寒論》，由附子、干姜、炙甘草組成，主治陽虛欲脫、冷汗自出、四肢厥逆、下利清谷、脈微欲絕，因其回陽溫里祛寒之顯效，被譽為回陽救逆第一方，現代臨床常用于治療冠心病心絞痛、心力衰竭、心肌梗等疾病[1-3]，具有良好的治療效果。四逆湯藥簡力專，全方僅由3味藥組成，然方中附子與甘草“相畏/相殺”配伍，附子與干姜“相須/相使”配伍，甘草與干姜“相須/相使”配伍，為中藥七情配伍之典范，充分體現了中藥配伍減毒增效的特點。目前，相關學者通過研究甘草減附子之毒以及干姜增附子之效2個環節，從化學成分、生物效應、體內過程[4-6]等多個層面闡釋了四逆湯的配伍機制。課題組在前期研究中，通過對附子配伍甘草前后的湯液及湯液沉積物的化學組分、湯液相態、藥理作用、胃腸吸收[7-11]等問題的探索，也在一定程度解釋了四逆湯“毒減而效不減”的配伍機制。然而，目前對四逆湯的研究更多的是以附子作為焦點，對甘草、干姜在配伍前后的變化研究相對薄弱。為進一步揭示四逆湯的配伍機制，本研究以甘草作為關注對象，以藥效成分甘草苷、甘草酸、甘草素、異甘草素為指標，對比分析甘草在配伍前后的藥效成分變化，為進一步研究奠定基礎。

　　1材料

　　Shimadzu LC-20AT 型高效液相色譜儀(配SPD-M20AT 檢測器， LC Solution 工作站，日本島津公司)，METTLER AE240 電子分析天平(1/10萬，梅特勒-托利多儀器有限公司)。

　　甘草苷(批號131217，純度大于98%)、甘草酸銨(批號140227，純度大于98%)、甘草素(批號131026，純度大于98%)、異甘草素(批號130329，純度大于98%)對照品均購自四川省維克奇生物科技有限公司。甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。白附片 Aconiti Lateralis Radix Praeparata(批號1403090)、干姜 Zingiberis Rhizoma(批號1403085)、炙甘草 Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Praeparata cum Melle(批號1401029)均購自四川省新荷花中藥飲片有限公司，經成都中醫藥大學盧先明教授鑒定，均符合2010年版《中國藥典》相關標準。

　　2方法

　　2.1色譜條件甘草苷、甘草酸：色譜柱為Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相0.05%磷酸水(A)-乙腈(B);梯度洗脫(0～8 min，81% A;8～11 min，81%～77% A;11～21 min，77%～76% A;21～44 min，76%～50% A;44～45 min，50%～0% A;45～50 min，0%～81% A);流速1.0 mL・min-1;進樣量10 μL;柱溫30 ℃;檢測波長250，276 nm。甘草素、異甘草素：色譜柱為Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相0.5%冰醋酸(A)-乙腈(B);梯度洗脫(0～10 min，80%～55% A;10～20 min，55% A;20～30 min，55%～30% A;30～35 min，30% A;35～40 min，30%～80% A);流速1.0 mL・min-1;進樣量10 μL;柱溫30 ℃;檢測波長276，370 nm。在上述色譜條件下，樣品中甘草苷、甘草酸、甘草素、異甘草素色譜峰的保留時間與對照品一致，成分色譜峰能達到較好的分離。對照品色譜圖見圖1，供試品色譜圖見圖2。

　　2.2對照品溶液的制備精密稱取甘草苷、甘草素、異甘草素對照品適量，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，分別制得每1 mL含甘草苷1.019 mg，甘草素0.335 mg，異甘草素0.139 mg的對照品溶液。精密稱取甘草酸銨對照品適量，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制得每1 mL含甘草酸銨2.050 mg(折合甘草酸為2.008 mg)的對照品溶液。

　　2.3供試品溶液的制備[12]甘草單煎樣品：稱取炙甘草飲片75 g，置圓底燒瓶中，加8倍量水浸泡0.5 h，回流提取，煮沸后小火保持微沸1.5 h，趁熱濾過;提取3次，合并濾液，減壓濃縮至適量，加水定容至100 mL。精密吸取2.5 mL，加水定容至25 mL，吸取5 mL，以12 000 r・min-1離心5 min，取上清液用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

　　甘草附子合煎樣品：稱取白附片飲片75 g和炙甘草飲片75 g，其他操作同上，即得。

　　甘草干姜合煎樣品：稱取炙甘草飲片75 g和干姜飲片50 g，其他操作同上，即得。

　　四逆湯樣品：稱取白附片飲片75 g，干姜飲片50 g和炙甘草飲片75 g，其他操作同上，即得。

　　2.4線性關系考察將上述對照品溶液分別稀釋，每個對照品溶液共6個濃度，得到一系列不同質量濃度的對照品溶液。取各個濃度的對照品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，按2.1項下色譜條件測定峰面積。以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)繪制標準曲線，得到回歸方程與相關系數，見表1。 　　2.5精密度試驗取同一份甘草單煎供試品溶液，按2.1項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積，計算峰面積的RSD。結果顯示，甘草苷、甘草酸、甘草素、異甘草素峰面積的RSD分別為0.96%，2.9%，

　　2.5%，2.0%，表明儀器的精密度良好。

　　2.6穩定性試驗取同一份甘草單煎供試品溶液，分別于制備后0，2，4，8，16，20，24 h進樣，記錄峰面積，計算峰面積的RSD。結果顯示，甘草苷、甘草酸、甘草素、異甘草素峰面積的RSD分別為2.0%，0.63%，1.9%，1.5%，表明在24 h內供試品溶液的穩定性良好。

　　2.7重復性試驗按2.3項下制法分別制備甘草單煎、甘草附子合煎、甘草干姜合煎、四逆湯供試品溶液，每個樣品平行6份，按2.1項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算峰面積的RSD。結果顯示甘草單煎供試品中甘草苷、甘草酸、甘草素、異甘草素峰面積的RSD分別為1.9%，1.1%，1.7%，2.8%;甘草附子合煎供試品中甘草苷、甘草酸、甘草素、異甘草素峰面積的RSD分別為2.7%，0.54%，1.3%，1.3%;甘草干姜合煎供試品中甘草苷、甘草酸、甘草素、異甘草素峰面積的RSD分別為1.8%，0.44%，0.95%，0.92%;四逆湯供試品中甘草苷、甘草酸、甘草素、異甘草素峰面積的RSD分別為0.70%，1.3%，1.3%，2.3%。表明本方法重復性良好。

　　2.8加樣回收率試驗精密稱取白附片飲片、炙甘草飲片和干姜飲片6份，按已知量(甘草苷、甘草酸、甘草素、異甘草素質量濃度分別為9.17，8.52，0.24，0.01 mg・g-1)分別精密加入一定量的甘草苷、甘草酸銨、甘草素、異甘草素對照品溶液，按2.3項下制法制備四逆湯供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，結果顯示甘草苷、甘草酸、甘草素、異甘草素的平均回收率分別為97.05%，100.3%，101.2%，101.5%，RSD分別為1.4%，1.7%，1.7%，2.0%。

　　2.9樣品的含量測定取各藥材飲片，按2.3項下制法制備供試品溶液，每個樣品平行3份，并按2.1項下的色譜條件進行測定，計算各供試品中4種藥效成分的含量及變化趨勢，見表2，3。

　　3結果與分析

　　由表2可知，甘草中4種藥效成分含量在配伍不同藥味之后均降低且趨勢相同，4種藥效成分含量均為甘草單煎液>甘草干姜合煎液>甘草附子合煎液>四逆湯。其中甘草苷質量濃度分別為11.18，9.89，9.67，9.17 mg・g-1;甘草酸質量濃度分別為20.76，15.58，11.30，8.52 mg・g-1;甘草素質量濃度分別為0.66，0.57，0.45，0.24 mg・g-1;異甘草素質量濃度分別為0.14，0.07，0.03，0.01 mg・g-1。

　　由表2分析可知，與甘草單煎液相比，甘草附子合煎液中甘草藥效成分含量下降，其作用機制可能為甘草中甘草酸、甘草素等酸性成分與附子中的烏頭類生物堿成分發生復合，溶解度減小而析出沉淀[8]，進而也從甘草的角度印證了甘草可解附子之毒的科學性;與甘草單煎液相比，甘草干姜合煎液中甘草藥效成分含量下降，藉此說明四逆湯中甘草與干姜亦存在相互作用，其作用機制推測為甘草中藥效成分通過與干姜中的化學成分發生復合，沉淀析出而造成含量降低，其結果也與《成方便讀・祛寒之劑》中“故以生附子之大辛大熱，解散表里之寒邪，不留安纖芥，仍以干姜之守而協濟之。用甘草者，一則恐姜附之烈，一則寓補正安中之意耳”的論述相契合，一定程度揭示了甘草可緩干姜烈性的科學內涵;與甘草單煎液、甘草附子合煎液、甘草干姜合煎液相比，四逆湯中甘草藥效成分含量進一步下降，且除甘草素以外，其他3種甘草藥效成分在四逆湯中的下降程度均小于甘草與附子、干姜單獨配伍下降程度之和，表明四逆湯中藥效成分的含量變化并非只是簡單的線性疊加，而是一個相互影響相互克制的系統，相互作用以達到“毒減而效存”的配伍目的。同時，通過表3 還可發現，甘草中的4種藥效成分含量在甘草附子合煎液中的下降程度均大于甘草干姜合煎液，其原因之一可能為甘草中的藥效成分與附子中的生物堿成分發生了更為深度的復合作用，原因之二可能為2種合煎液中附子和干姜的用量不同而造成了差異(附子75 g，干姜50 g)，而其具體原因也有待進一步研究。

　　4討論

　　四逆湯功善溫中祛寒，回陽救逆，對心肌缺血再灌注損傷、動脈粥樣硬化、冠心病、心絞痛等心血管疾病的治療具有良好效果[13]。傳統觀點認為，附子生物堿類成分即為四逆湯藥理活性成分，現代研究表明甘草對心血管系統也具有較強的藥理作用，作用機制與抗氧化、抗心律失常、抗缺血缺氧以及調血脂等有關，其主要活性成分為甘草皂苷類化合物和甘草黃酮類化合物。同時，2010年版《中國藥典》將甘草苷、甘草酸規定為甘草飲片項下的含量測定指標成分，將甘草酸作為四逆湯的質量評價指標。因此，本研究從四逆湯的功效主治出發，結合甘草的質量要求以及相關藥理作用，將甘草苷、甘草酸、甘草素和異甘草素作為指標成分。

　　在本論文的基礎上，后期將研究甘草藥效成分在不同配伍中的時間降解曲線，分析不同配伍對甘草藥效成分的降解貢獻，并聯系四逆湯全方的降解曲線，探討藥對與全方之間是否存在疊加效應，進一步揭示四逆湯中甘草與其他藥味配伍藥效成分含量變化的規律;利用LC-MS等技術，定性與定量分析甘草不同樣品中湯液沉積物的化學成分，研究甘草與附子、干姜之間的作用機制，完善四逆湯的物質基礎研究;同時結合藥效學方法繼續探討甘草單煎液、甘草附子合煎液、甘草干姜合煎液以及四逆湯的藥效學差異，進一步揭示四逆湯配伍的科學內涵。 　　[參考文獻]

　　[1]雷蕊娥，康健. 四逆湯治療冠心病心絞痛64例療效分析[J]. 中國實用醫藥，2012，7(18)：193.

　　[2]喻少峰. 四逆湯治療心力衰竭臨床療效及其對血漿BNP水平的影響[J]. 河南中醫，2014，34(5)：801.

　　[3]趙小祺，王春光，焦宏，等. 四逆湯對急性心肌梗死溶栓后再灌注損傷的保護作用[J]. 中國老年學雜志，2014，34(3)：590.

　　[4]葉強，郭一平，彭成，等. 附子無姜不熱的成分研究[J]. 中成藥，2013，35(5)：1035.

　　[5]馬天舒，葛迎春，賈玉紅，等. 附子干姜不同藥對配伍提取物對小鼠脾細胞增殖的影響[J]. 遼寧中醫雜志，2012，39(5)：948.

　　[6]王志琪，曾嶸，譚志榮，等. 附子與甘草配伍前后烏頭堿和甘草次酸在大鼠體內的藥動學比較[J]. 中成藥，2012，34(12)：2305.

　　[7]章津銘，李玲，高飛，等. 附子配伍甘草前后湯液沉積物的HPLC-MS化學組成分析[J]. 藥學學報，2012，47(11)：1527.

　　[8]章津銘，傅超美，何宇新，等. 附子-甘草配伍前后湯液中沉積物的化學組分對比研究[J]. 中草藥，2013，44(2)：165.

　　[9]陳秋薇，章津銘，季寧平，等. 附子-甘草藥對配伍前后湯液相態對比[J]. 中國實驗方劑學雜志， 2014，20(2)：92.

　　[10]李瑩，傅超美，任波，等. 基于MI-RI大鼠心肌細胞代謝組學研究四逆湯中附子配伍甘草解毒增效機制[J]. 中國中藥雜志，2014，39(16)：3166.