[摘要]研究地道藥材禹州漏蘆主要活性成分總黃酮(FELT)對佐劑性關節炎(AA)大鼠Wnt信號的影響。采用大鼠關節炎評分法和MTT檢測FELT對AA大鼠的治療作用，Real-time qPCR檢測FELT灌胃治療對AA大鼠滑膜中Wnt信號關鍵基因β-catenin，C-myc和cyclin D1表達的影響，Real-time qPCR檢測FELT灌胃治療對AA大鼠滑膜中Wnt信號上游負調控基因SFRP 1，2，4，5表達的影響。結果發現FELT對AA大鼠關節炎評分和MTT值有顯著的抑制作用，對Wnt信號關鍵基因β-catenin，C-myc和cyclin D1表達有顯著的抑制作用，對SFRP 1，2，4表達有顯著的上調作用。FELT灌胃治療對AA大鼠有較好的治療作用，這種治療作用可能是通過對Wnt信號的抑制實現的。

　　[關鍵詞]省級期刊論文發表,禹州漏蘆總黃酮,佐劑性關節炎,Wnt,β-catenin

　　Flavonoids of Echinps latifolius suppress Wnt signaling in adjuvant arthritis rats

　　MIAO Cheng-gui1，2，3*， XU Jian1， GAO Hu1， LIU Liang-liang1， ZHOU Guo-liang1， QIN Mei-song1， CHEN Jian-zhong1， LI Cheng-feng1

　　(1. Food and Drug College， Anhui Science and Technology University， Bengbu 233100， China;

　　2.College of Pharmacy， Anhui Medical University， Heifei 230032， China;

　　3. Poultry Disease Monitoring Anhui Key Laboratory， Anhui Science and Technology University， Bengbu 233100， China)

　　[Abstract]The role of flavonoids of Echinps latifolius(FELT) in Wnt signaling was investigated in adjuvant arthritis (AA) rats. The therapeutic effects of FELT on AA rats were detected by rat arthritis score and MTT. The effect of FELT gavage treatment on the Wnt signaling key gene β-catenin， C-myc and cyclin D1 in synovium from AA rats was detected by Real-time qPCR， and the effects of FELT gavage treatment on the upstream negative regulation gene SFRP 1，2，4，5 in synovium from AA rats were detected by Real-time qPCR. The results showed that FELT gavage treatment significantly inhibited arthritis score and MTT values in AA rats， significantly inhibited the expression of the Wnt signaling gene β-catenin， C-myc and cyclin D1， significantly up-regulated the expression of the upstream negative regulation gene SFRP 1，2，4. FELT has a better therapeutic effect for AA rats.

　　[Key words]flavonoids of Echinps latifolius; adjuvant arthritis; Wnt; β-catenin

　　doi：10.4268/cjcmm20150125

　　類風濕性關節炎(rheumatoidarthritis，RA)是一種慢性、系統性、多關節性疾病，發病機制仍不清楚，世界范圍內RA發病率為0.5%～1.0%，部分地區高達5%[1-2]。成纖維細胞樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)在RA發病機制中發揮重要作用[3-4]。Wnt信號參與了RA的發病機制，與FLS異常活化增殖、持續的滑膜炎癥、軟骨侵蝕、骨的破壞等有關，Wnt通路相關分子可能是潛在的RA治療靶點[5]。禹州漏蘆為菊科華東藍刺頭Echinps latifolius Tausch的干燥根，主產于安徽、湖北、河南等省，其中以安徽、湖北的產量最大、質量最好。禹州漏蘆具有抗炎、鎮痛、耐缺氧、抗疲勞、降血壓及降血脂等藥理作用，是一種極具研究開發價值的中草藥[6]。本文采用滁州產禹州漏蘆為研究對照，分離提取其總黃酮，采用佐劑性關節炎大鼠為AA，大鼠關節炎評分法和MTT檢測禹州漏蘆總黃酮(FELT)對AA大鼠的治療作用，Real-time qPCR檢測FELT灌胃治療對AA大鼠Wnt信號和對Wnt信號上游負調控基因SFRP 1，2，4，5表達的影響，為禹州漏蘆的綜合開發積累實驗基礎，為RA治療提供新思路。 　　1材料

　　1.1儀器Applied Biosystems Gene Amp StepOneTM Real-time qPCR System(美國ABI公司);CO2培養箱(Thermo);超凈工作臺(江蘇凈化儀器設備有限公司);倒置熒光顯微鏡、倒置顯微鏡(奧林巴斯);ChemiScope3400 Mini化學發光成像(上海勤翔科學儀器有限公司);FA/JA型電子天平(上海精密科學儀器有限公司);101AS-3型數顯恒溫干燥箱(上海浦東躍欣科學儀器廠)。

　　1.2藥品與試劑禹州漏蘆采集于安徽省滁州市鳳陽縣鳳陽山地區，經安徽中醫藥大學王德群教授鑒定為菊科植物藍刺頭E. latifolius干燥根，正品。禹州漏蘆總黃酮(FELT)由安徽科技學院藥學系藥物化學室研制。取安徽滁州產禹州漏蘆干燥根，乙醇提取后減壓濃縮，水溶液調pH至2.0，乙醚萃取后有機相精制濃縮，水相大孔樹脂吸附，二者混合后濃縮為浸膏得FELT，以蘆丁為對照品，HPLC檢測FELT純度為82.56%;QuantiFast SYBR Green PCR試劑盒(Qiagen公司);逆轉錄試劑盒(Fermentas);β-catenin，C-myc，cyclin D1等定量PCR引物(上海生工生物工程技術服務有限公司)。

　　2方法

　　2.1AA大鼠制備SD雄性大鼠，體重180～200 g，安徽醫科大學實驗動物中心提供(合格證號：皖醫動準01號)，隨機分為6組：正常組、AA組、FELT低、中、高劑量組(50，100，150 mg・kg-1)、布洛芬陽性對照組(8 mg・kg-1)，每組10只[7-8]。AA組及各給藥組以福氏完全佐劑于每只大鼠右后足跖皮內注射0.1 mL致炎，正常對照組注射0.1 mL PBS。

　　2.2AA大鼠關節炎關節炎評分是基于對佐劑性關節炎大鼠不同部位的癥狀進行量化評價，具體評分標準如下。耳朵：0分，無結節和紅腫;1分，1只耳朵出現結節和紅腫;2分，2只耳朵都出現結節和紅腫。鼻子：0分，無結節和紅腫;1分，鼻子上出現結節和紅腫。尾巴：0分，無結節和紅腫;1分，尾巴出現結節和紅腫。足爪：0分，足爪無結節和紅腫;1分，1只足爪出現結節和紅腫;2分，2只足爪出現結節和紅腫;3分，3只足爪出現結節和紅腫;4分，4只足爪出現結節和紅腫。上述評分的加和即為每只佐劑性關節炎大鼠評分，最高評分為8分。

　　2.3大鼠滑膜FLS原代培養引頸處死大鼠，無菌條件下取滑膜組織，D-Hanks液反復漂洗組織塊3次后剪成約1～2 mm3小塊。37 ℃，5%CO2培養箱內培養2 h，使其貼壁。取出培養瓶加入預溫的20%小牛血清DMEM培養液3 mL，再置37 ℃，5%CO2培養箱中繼續培養。待滑膜FLS長出組織塊較多后，棄除組織塊，繼續培養至細胞覆蓋瓶底90%，0.5 g・L-1胰蛋白酶消化細胞傳代培養。實驗用細胞為傳代3～5次細胞。

　　2.4MTT檢測FLS增殖活性用含15%小牛血清的DMEM培養液混懸FLS，制備FLS懸液，濃度為1×105個/mL。將FLS懸液加至96孔培養板中，每孔100 μL，置于37 ℃，5%CO2條件培養24 h。FLS貼壁后換新的培養液100 μL，繼續培養72 h后。每孔加MTT液10 μL，繼續培養4 h，吸棄上清液，加入100 μL DMSO，酶標儀檢測，結果以3個復孔的均值表示。

　　2.5Real-time qPCR檢測FELT對AA大鼠滑膜β-catenin，C-myc和cyclin D1表達的影響分離對照大鼠和AA大鼠滑膜組織，采用Real-time qPCR檢測FELT對AA大鼠滑膜Wnt信號通路關鍵基因β-catenin，C-myc和cyclin D1表達的影響。引物序列見表1。

　　2.6Real-time qPCR檢測FELT對AA大鼠滑膜SFRP 1，2，4，5表達的影響分離對照大鼠和AA大鼠滑膜組織，采用Real-time qPCR檢測FELT對AA大鼠滑膜中Wnt信號上游負調控基因SFRP 1，2，4，5表達的影響。引物序列見表1。

　　2.7統計學分析數據分析采用SPSS 17.0軟件，所有數據結果均以±s表示，組間比較采用One-Way ANOVA檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

　　3結果與分析

　　3.1對AA大鼠的治療作用AA大鼠在造模后第12天繼發性炎癥明顯，四肢出現紅腫，關節炎評分顯著增高。相較于AA組大鼠，FELT各治療組大鼠關節炎評分顯著降低，見圖1。

　　3.2對AA大鼠FLS異常增殖的抑制作用與AA組大鼠相比，FELT各治療組大鼠MTT值顯著降低，見圖2，提示FELT對AA大鼠FLS異常增殖有抑制作用。

　　3.3Real-time qPCR檢測FELT對AA大鼠滑膜β-catenin，C-myc和cyclin D1表達的影響與AA組大鼠相比，FELT治療組大鼠滑膜中經典Wnt信號通路關鍵基因β-catenin，C-myc和cyclin D1表達均顯著降低，見圖3，表明FELT具有抑制AA大鼠滑膜β-catenin，C-myc和cyclin D1表達和抑制Wnt信號的作用。

　　3.4Real-time qPCR檢測FELT對AA大鼠滑膜SFRP 1，2，4，5表達的影響與AA組大鼠相比，FELT治療組大鼠滑膜中Wnt信號通路上游負調控基因SFRP 1，2，4表達均顯著升高，見圖4，表明FELT可能通過對Wnt上游負調控基因SFRP 1，2，4表達的上調抑制AA大鼠Wnt信號激活。 　　4討論

　　按照信號通路的激活是否依靠β-catenin的活化，Wnt通路分為經典通路和非經典通路。大多數Wnt信號的研究都著眼于β-catenin介導的Wnt經典信號通路[9]。例如，在結腸癌中，轉入細胞核中的β-catenin上調myc，cyclin D1基因表達，促進細胞的增殖癌變[10]。在非洲蟾蜍中，轉入細胞核中的β-catenin上調纖維連接蛋白、細胞外基質蛋白表達，促進細胞的黏附和活化[11]。有證據表明ERK家族激酶能夠被β-catenin經典信號激活，參與數種細胞分化過程。Wnt非經典信號通路包括Wnt/Ca2+信號通路和細胞極性通路。研究表明Wnt4和Wnt5a激活Wnt/Ca2+信號通路，此激活過程通過特定的G蛋白激活磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)，PI-PLC水解磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(PIP2)生成二脂酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)。細胞膜上的DAG在Ca2+和磷脂酰絲氨酸協助下激活蛋白激酶C(PKC)，PKC作用于細胞膜受體等相應靶蛋白，使之磷酸化影響信號傳導。細胞極性通路前半部分與Wnt 經典通路完全相同， 不同之處在于Dvl由保守區域DIX，PDZ和DEP組成，DIX和PDZ介導經典Wnt 信號通路，DEP介導細胞極性通路的激活，例如Wnt7a與Fz受體結合激活細胞極性通路[12]。

　　Wnt信號調控細胞增殖分化、細胞癌變、腫瘤侵襲生長等，與腫瘤的發病機制密切相關，Wnt信號在調控RA發生發展過程中同樣起重要作用[13-14]。與正常人滑膜組織相比，Wnt1，Wnt5a，Wnt5b，Wnt7b和Fz5在RA病人滑膜中顯著高表達，Wnt1，Wnt5a和Fz5的高表達與RA炎癥程度有關[15]。在RA病人關節FLS中同樣檢測到Wnt1，Wnt5a和Fz5高表達，進一步印證Wnt1，Wnt5a和Fz5與RA的密切相關[16]。SFRP作為Wnt的負調控蛋白分子在RA滑膜組織和FLS中都有表達，即RA特異的疾病內環境誘導了SFRPs的差異表達。SFRPs與炎癥因子表達及RA發病機制可能有關[17]。

　　本文研究了FELT對AA大鼠的治療作用及其信號通路，為滁州產禹州漏蘆的綜合利用開發積累實驗基礎，為RA防治提供新的思路。

　　[參考文獻]

　　[1]Keen H I， Emery P. How should we manage early rheumatoid arthritis from imaging to intervention[J]. Curr Opin Rheumatol， 2005， 17(3)： 280.

　　[2]Huang Y J， Shiau A L， Chen S Y， et al. Multivalent structure of galectin-1-nanogold complex serves as potential therapeutics for rheumatoid arthritis by enhancing receptor clustering[J]. Eur Cell Mater， 2012， 13(23)： 170.