代謝組學是繼基因組學、轉錄組學、蛋白組學后新發展起來的全新的組學技術，其把人體當做一個完整的系統，以高通量檢測終端代謝產物技術，并通過多維復雜數據進行降維和信息挖掘，分析人體在不同生理和病理階段的代謝特征[1]。代謝組學這種“整體觀念”被認為與中醫理論不謀而合[2]，因此，代謝組學已廣泛應用于中醫復方藥物研究，療效評價和中醫證候研究[3-5]。艾滋病(acquiredimmunedeficiencysyndrome，AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)引起的以免疫缺陷為特征的傳染性疾病,目前尚無有效的疫苗預防，也無有效的藥物可以將其完全治愈。雖然AIDS在中醫領域是新發疾病，但治療已取得一定效果[6-7]，準確的辨證分型是中醫治療疾病的關鍵，AIDS的中醫治療也不例外。代謝組學技術的發展，為研究中醫證候提供了新的思路。本研究擬選擇AIDS常見中醫證候脾腎虧虛的患者為研究對象，健康人作為對照，以超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜(ultra-performanceliquidchromatographycoupledtoquadrupoletimeofflightmassspectrometry，UPLC-QTOF/MS)技術測定其血清代謝物，使用多元分析方法分析艾滋病脾腎虧虛證代謝特征，為AIDS辨證分型提供參考。

　　資料與方法

　　1.研究對象2017年6月于河南AIDS高發區共納入37例研究對象。AIDS脾腎虧虛(AIDSPQ)組19例，其中男性10例，女性9例，平均年齡(48.32±5.85)歲;健康(JK)組18名，其中男性9名，女性9名，年齡(44.44±4.73)歲。兩組性別、年齡分布差異無統計學意義，具有可比性。2.診斷標準艾滋病診斷標準：依據2015年國家衛生和計劃生育委員會推薦的《艾滋病診療指南》[8]的診斷標準。脾腎虧虛證診斷標準按照2016年國家衛生和計劃生育委員會和國家中醫藥管理局頒布的《艾滋病中醫(成人)診療方案》：主癥：面色少華，神疲乏力;次癥：納呆、便溏、或形寒肢冷，或腰酸、腰痛，或耳鳴，舌質淡，苔白或滑，脈沉細或弱。健康人診斷標準：HIV抗體陰性，無明顯癥狀，身體健康無臟器嚴重疾病或慢性病急性發作者。3.納入標準AIDSPS組：符合艾滋病診斷標準，符合脾氣虛證診斷標準(兩名副高及以上職稱中醫專家診斷一致)，年齡18～60歲，簽署知情同意書。JK組：符合健康人診斷標準，年齡18～60歲，簽署知情同意書。4.排除標準不符合以上診斷標準和納入標準者，神志不清、癡呆、各種精神病患者，非感染艾滋病所患的臟器嚴重疾病者，原發性免疫缺陷者，激素化療等引起的繼發性免疫缺陷者，血液病者，其它原因引起的中樞神經系統疾病者，未簽署知情同意書者。5.試劑乙腈(色譜純級，購自MerckDarmstadt，Germany公司);甲酸(HPLC/SPECTRO級，購自MerckDarmstadt，Germany公司);甲醇(色譜純級，購自MerckDarmstadt，Germany公司)。6.儀器液質聯用儀：美國WatersACQUITYTMI-ClassUPLC系統，XevoG2-XSQ/TOF質譜儀，配有Lock-spray接口，電子霧離子源(ESI)，Masslynx4.1質譜工作站;高速冷凍離心機：上海力申科學儀器有限公司;真空離心濃縮儀：英國GeneVac公司;電子天平：十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多集團);低溫冰箱：RevcoValueULT386-3-V42，ThermoScientific;超純水器：上海摩勒科學儀器有限公司。7.血樣采集與處理使用肝素鈉抗凝管收集符合納入標準的研究對象的清晨空腹時靜脈血5mL，13000r/min離心10min，取上清液于-80℃冷凍保存備用。檢測前，在室溫下解凍，解凍后取200µL，加甲醇600µL，渦旋振蕩30s，于4℃13000r/min高速離心10min，精密移取上清液440µL，采用真空離心濃縮儀濃縮至干;殘渣用200µL甲醇溶解，渦旋振蕩60s，于15000r/min高速離心10min，取上清液進樣檢測。8.液相色譜-質譜條件液相色譜條件：色譜柱為AcquityUPLCHSST3C18(2.1mm×100mm，1.8µm);流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫程序：0～9min，5%A;9～19min，40%A;19～25min，100%A;25～32min，5%A;流速：0.3mL/min;進樣盤溫度：4℃;柱溫：4℃;進樣量：3µL。質譜條件：毛細管電壓：3kV，質荷比范圍：50～1200，采用負離子掃描模式。離子源溫度110℃，脫溶劑氣溫度450℃，錐孔電壓40V，離子能量0.8V;錐孔氣流量為50L/h，脫溶劑氣流量800L/h。9.數據分析檢測得到的得到所有樣品的總離子流圖，使用Water公司自帶的WatersProgenesisQI2.0sofware(NonlinearDynamics，Newcastle，U.K.)進行數據預處理，包括奇異點剔除、去噪、基線校準、重疊峰分析、峰對齊、峰識別、峰特征提取、標準化、歸一化等。所得質譜矩陣數據導出到EZinfo3.0或SIMCA-P13.0(Umetrics，umeå，Sweden)進行PCA和OPLS-DA等多元分析。通過構建基于OPLS-DA模型，根據變量的重要變量因子(variableimportanceintheprojection，VIP)值挑選差異物，并對挑選出的變量進行獨立樣本t檢驗進行驗證。差異物VIP>2，P<0.05和變化倍數>3或者<0.33確定為組間的差異代謝物。使用Water公司自帶的WatersProgenesisQI2.0software推測可能代謝物的物質。

　　結果

　　1.PCA結果UPLC-QTOF/MS技術對血清檢測結果進行預處理后，首先采用PCA方法對AIDSPS組和JK組血清樣本進行多元分析，共得到有2個主成分的模型(R2=0.337，Q2=0.221)，得到的散點圖(圖1)顯示兩組可以得到區分，有明顯的差異性。2.OPLS-DA結果本研究的OPLS-DA模型，R2Y=0.972，Q2=0.950，表明模型有較好的解釋性和預測性。模型的方差分析結果顯示F=152.06，P<0.05，模型有效。OPLS-DA模型的得分圖見圖2A，結果顯示，此模型可以把AIDSPS組與JK組明顯區分。OPLS-DA模型置換檢驗(n=200)中左端任何一次隨機排列產生的R2、Q2值均小于右端的原始值，Q2截距值等于或小于0，則表明模型有效[9]。R2、Q2值均小于右端的原始值，Q2截距值<0，則表明模型有效，沒有過度擬合，見圖2B。3.差異代謝物篩選結果在OPLS-DA模型中VIP>2，變化倍數>3.00或者<0.33，并通過t檢驗，P<0.05的變量確定為組間差異代謝物，共確定差異代謝物共11種，AIDSPQ組與JK組比較降低的是：磷脂酰肌醇、前原卟啉Ⅸ;升高的是：番茄素、牛磺膽酸、甘氨酸、甘氨膽汁酸、牛磺去氧膽酸、偏酸、葡萄糖苷酸、鵝去氧膽酸甘氨酸偶聯物、膽紅素，結果詳見表1。

　　討論

　　中醫證候乃是疾病發生發展過程中生理病理的總結，是中醫了解疾病的關鍵所在。證候理論是中醫臨床治療疾病的總綱，證候分類方法則是中醫診治疾病進行辨證的根基。然而，中醫證候理論和證候分類的物質基礎近年來并未取得明顯進展[10]，究其根本可能是仍然缺乏適宜的方法和途徑，獲得行業認可的科學數據支撐中醫證候理論，從而使中醫證候理論保持良好的持續發展。代謝組學的發展為中醫證型研究提供了新的方法，代謝組學已經越來越多的運用于中醫證型研究領域并取得了一定的成果[11-12]。代謝組學技術在AIDS中醫證候領域也有應用[13-14]。許前磊等[15-16]運用氫核磁共振技術檢測出AIDS肺脾氣虛證患者與健康人尿液代謝差異代謝物為α-氨基丁酸、甲基丁二酸等物質;用液質聯用技術檢測出AIDS濕熱內蘊證患者與健康人血液代謝差異代謝物為酰基甘氨酸、溶血磷脂酰膽堿。馬素娜等[17]運用液相色譜質譜分析技術檢測出艾滋病肺脾氣虛證組和艾滋病氣陰兩虛證患者尿液潛在的4種差異代謝物。王娟等[18]利用高效液相色譜質譜聯用技術將AIDS肺脾氣虛證患者和健康志愿者血液代謝輪廓得以明顯區別，并推斷出的9種可能的差異代謝物。本研究選擇AIDS脾腎虧虛證患者為研究對象，健康人作為對照，以UPLC-QTOF/MS技術測定其代謝產物，可以將兩組患者明顯區分，并發現了11種代謝差異物，分別是磷脂酰肌醇、前原卟啉Ⅸ、番茄素、牛磺膽酸、甘氨酸、甘氨膽汁酸、牛磺去氧膽酸、偏酸、葡萄糖苷酸、鵝去氧膽酸甘氨酸偶聯物、膽紅素。這些物質主要涉及脂質代謝，特別是膽汁酸代謝途徑;其次涉及氨基酸代謝途徑，如甘氨酸和前原卟啉Ⅸ。代謝組學技術對于脾腎虧虛證的研究尚未見報道，戰麗彬等[19]運用UPLC-QTOF/MS技術檢測出脾氣虛證患者血漿中甘油磷酸膽堿和肉堿低于健康人，施旭光等[20]使用核磁共振氫譜在脾氣虛證患者和健康志愿者尿液中共篩選得到谷氨酸、甲硫氨酸、α-酮戊二酸、二甲基甘氨酸、肌酐、牛磺酸及葡萄糖7種差異代謝產物;董飛俠等[21]發現腎陽虛患者與健康人尿液對照，代謝差異物為丙氨酸、胺基丙二酸二乙酯、脯氨酸、檸檬酸、馬尿酸和組胺等物質。代謝組學對相同或相近證型的研究結果都不盡相同，可能是由于證候判斷、檢測標本或者檢測技術差異。運用代謝組學技術探索中醫證候的分型雖然取得一定的進展，但由于代謝組學技術的靈敏性，其受到的影響因素很多，而且由于生物代謝的復雜性及中醫證候的多態性，其依然存在局限性。但不可否認用代謝組學技術研究中醫證候有廣闊的發展前景和潛力。

　　《艾滋病脾腎虧虛證血液代謝特征》來源：《中華中醫藥雜志》，作者：金艷濤 楊春玲 袁君 馬秀霞 武悅 許前磊 劉志斌