摘要 為了研究多壁碳納米管(MWCNTs)聯合納秒脈沖電場(nsPEF)影響離體細胞活性的劑量效應，采用 CCK-8 檢測法對比分析皮膚癌 A375 細胞活性隨場強 E、脈寬 τ、脈沖個數 N 等單因素的變化規律。研究表明，細胞活性隨場強和脈寬的變化具有閾值效應(S 型變化)，而隨脈沖個數的變化無明顯的閾值效應(指數型變化)。細胞活性隨脈沖注入能量 E(τN) 0.5 的增加呈現 S 型下降。基于 logistic 模型利用一元非線性回歸分析方法分別擬合得到細胞活性與三個脈沖參數間的函數關系。同時，建立細胞活性與多因素之間的歸一化關系。結果表明，MWCNTs 的加入不影響細胞活性與脈沖參數間的變化規律，但是明顯降低了 nsPEF 殺傷腫瘤細胞所需要的幅值，從而可以有效提高 nsPEF 在腫瘤治療中的電氣安全性。

　　關鍵詞：多壁碳納米管 納秒脈沖電場 細胞活性 logistic 模型 歸一化關系

　　0 引言

　　納秒脈沖電場(nanosecond pulsed electric field， nsPEF)不需要毒性化療藥物的參與就能通過誘導凋亡而使腫瘤組織縮小甚至消失，避免了炎癥、潰瘍與藥物的副作用[1,2]，對于腫瘤治療具有特別重要的意義。然而，nsPEF 必須采用高場強，在實驗過程中需要借助電極將幅值非常高的脈沖電場引入到腫瘤組織，而過高的場強容易引起靶向組織的沿面放電[3,4]，這也會對治療過程的順利進行、治療設備的可靠性產生影響。近年來，碳納米管(carbon nanotubes，CNTs)優異的電學特性在生物電效應中的應用潛力逐漸引起人們的關注。CNTs 是一種具有特殊結構(徑向尺寸為納米級，軸向尺寸為微米級)的一維量子材料，并且由于碳納米管的結構與石墨的片層結構相同，所以具有高電導率[5]。具備大長徑比以及優良電導率的 CNTs 可以增強局部場強[6]，國外一些學者已經將 CNTs 的這一特性應用到脈沖電場治療腫瘤的領域中。根據卷曲層數的差異，CNTs 可以分為單壁碳納米管(single-walled carbon nanotubes， SWCNTs)和多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs)[7]。由于 MWCNTs 的毒性低于 SWCNTs[8]，所以 MWCNTs 在生物電磁中的應用更為廣泛。 Stacey 等將 MWCNTs 引入到 nsPEF(50 kV/cm， 300 ns，8 個脈沖)殺傷胰腺癌細胞系 PANC1 的實驗 中 ， 利 用 臺 盼 藍 檢 測 細 胞 存 活 率 [9]。 與 不 加 MWCNTs 的實驗相比，MWCNTs 的引入可以使細胞存活率降低 2.3 倍，證明 MWCNTs 獨特的電子特性與脈沖電場在殺傷腫瘤細胞中的協同作用。Raffa 等在脈沖電場(45-55 V/cm，40 ms，1 Hz，500 個脈沖)處理 HN9 及 CRFK 細胞的過程中將 MWCNTs (5-10 μg/ml)加入到細胞懸浮液，以此促進細胞的透化率，從而增強細胞對藥物大分子的攝取，利用臺盼藍染料代替藥物大分子檢測細胞的通透性[10]。實驗證明 MWCNTs 的引入可以將細胞通透性由 4% 提高到 80%，并在該實驗的基礎上提出 MWCNTs 在脈沖電場作用下的介電響應可能是導致電穿孔增強的原因。Wang 等在 MWCNTs 的存在下將脈沖電場(50 V/cm，40 ms，5 Hz，500 個脈沖)作用于乳腺癌細胞[11]。利用臺盼藍檢測到細胞膜即時透化率增加至 38.62%，是不含 MWCNTs 實驗的 2.77 倍。此外，還觀察到細胞發生了不可逆電穿孔，在脈沖處理后 24 小時僅有 39.23%的細胞存活，而不存在 MWCNTs 的細胞存活率為 87.01%。Liu 等利用有限元法基于介電電泳理論仿真研究了單根 MWCNTs 與細胞膜在脈沖電場處理下的作用過程[12]。結果表明，MWCNTs 尖端在電場中引起的介電泳力能夠實現細胞膜快速的機械變形，從而增強細胞電穿孔效應。以上研究都從不同角度證明了 MWCNTs 增強脈沖電場殺傷腫瘤細胞效果的可行性。但是，迄今為止，MWCNTs 增強脈沖電場殺傷癌細胞效果的相關研究也只是在單一脈沖因素、特定參數范圍的基礎上驗證 MWCNTs 的引入具有增強脈沖電場生物電效應的作用，沒有更加系統、全面地建立 MWCNTs 聯合 nsPEF 殺傷腫瘤細胞的劑量效應。為了對后續開展機理研究選擇脈沖參數提供必要的參考依據，首先必須從宏觀角度研究引入 MWCNTs 后不同脈沖參數下的 nsPEF 對離體細胞的殺傷效果。對此，本文將在探究 MWCNTs 毒性的基礎上系統地研究有無 MWCNTs 時細胞活性隨場強、脈寬、脈沖個數等單因素的定性變化規律和定量函數關系，并建立細胞活性與多因素的歸一化關系,以期為后續在腫瘤組織中的進一步研究提供參考。

　　1 材料與方法

　　1.1 細胞培養將人皮膚癌

　　A375 細胞系(由第三軍醫大學基礎醫學研究院捐贈)置于高糖 DMEM 培養基(血清和抗生素的占比分別為 10%和 1%)中，于 CO2 體積分數為 5%、溫度為 37℃、飽和濕度的環境中生長，1-2 天傳代一次。

　　1.2 MWCNTs 毒性的確定

　　MWCNTs 分散液(W/V=20 000 μg/ml)購置于中科院成都有機化學有限公司，所用 MWCNTs 的外徑和長度分別為 8-15 nm 和 50 μm 左右，其在透射電子顯微鏡(transmission electron microscope， TEM)下的微觀結構如圖 1 所示。取不同體積 MWCNTs 分 散 液 于 新 鮮 培 養 基 中 ， 分 別 調 整 MWCNTs 的最終濃度為 0 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml、300 μg/ml、400 μg/ml。將處于對數生長期的 A375 細胞用 0.25%的胰酶消化后離心 5 分鐘(800 轉/分鐘)，棄去上清液，用上述含有不同濃度 MWCNTs 的培養基制成細胞懸液，調整細胞濃度為 1×106 cells/ml。將上述細胞懸液于室溫下靜置 1 小時后用 PBS 離心清洗兩遍，并用不含 MWCNTs 的新鮮培養基重懸(細胞濃度為 1×105 cells/ml)，取 200 μl 溶液于 96 孔板中，在 CO2 體積分數為 5%、溫度為 37℃、飽和濕度的環境中繼續培養 8 小時。利用 CCK-8 試劑盒檢測各個實驗組的細胞活性，對照組為 MWCNTs 濃度為 0 μg/ml 的細胞懸液。

　　1.3 細胞活性的檢測使用

　　CCK-8 細胞增殖實驗評估細胞活力，當含有細胞的 96 孔板在孵箱中培育 8 小時后，利用移液器緩慢吸掉 96 孔板上清液，用 PBS 清洗兩遍并重新加入 110 μl 培養基與 CCK-8 的混合溶液(培養基與 CCK-8 的比例為 10:1)，繼續于孵箱中培養 1.5 小時。在該測定中，CCK-8 可以被細胞線粒體內的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產物 Formazan。利用酶標儀(EPOCH2，Biotek)測量每組實驗的吸光度，波長設定為 450 nm。細胞活性=(實驗組吸光值-空白組吸光值)/ (對照組吸光值-空白組吸光值)×100%，其中空白組為不含細胞的混合培養液。

　　1.4 nsPEF 系統

　　實驗平臺如圖 2 所示，相關裝置包括：實驗室自制的納秒脈沖發生器[13]、現場可編程邏輯門陣列( Field-Programmable Gate Array ， FPGA) 模 塊(AX301，Alinx)、個人電腦(PC)、示波器(WavePro 7 Zi–A，Teledyne Lecroy)、高壓探頭(PPE5KV， Teledyne Lecroy)、 皮 爾 森 線 圈 ( 2877， Pearson Electronics)、電擊杯(BTX，容積 450 μl，間距 2 mm)。在 PC 端對 FPGA 模塊編程，通過控制 FPGA 產生特定脈寬及頻率的信號以控制納秒脈沖發生器的輸出，發生器的輸出直接連接到裝有細胞懸浮液的電擊杯兩端，同時利用示波器對細胞懸液兩端的電壓以及流經懸液的電流信號進行采集。幅值為 1 kV，脈寬為 300 ns 時，脈沖電壓和電流波形如圖 3 所示。

　　1.5 nsPEF 處理細胞的實驗方案

　　表 1 為實驗所采用的脈沖參數水平值，固定脈沖頻率為 1 Hz，MWCNTs 濃度為安全劑量下的最大值，其余參數(場強 E、脈寬 τ、脈沖個數 N)均為 5 水平。當探究細胞活性隨某一脈沖參數的影響規律時，其余參數均設定為中間值，例如研究場強對細胞活性的影響規律，脈寬和脈沖個數分別設定為 300 ns 和 100。對于每一組實驗方案，分別在加 MWCNTs 以及不加 MWCNTs 的情況下實施。為了使大部分細胞在 nsPEF 處理期間承受更均勻的電場，將貼壁生長型細胞酶解為細胞懸液，然后取 70 μl 細胞懸液于電擊杯中，此時大部分細胞將處于場強更加均勻的電擊杯中間區域，并對其進行相應的 nsPEF 處理。對照組設置為將同等體積不加 MWCNTs 的細胞懸液加入電擊杯但是不對其進行 nsPEF 處理。脈沖處理后，利用 CCK-8 試劑盒測量各個實驗組的細胞活性，相關操作與 MWCNTs 毒性實驗相同。

　　1.6 數據的統計學分析

　　采用 OriginPro 軟件對數據進行統計學分析，數據均用 x(均值)±s(標準差)表示，利用單因素方差分析評估實驗數據的顯著性差異。P<0.05 為實驗數據具有顯著性差異。

　　2 結果

　　2.1 MWCNTs 毒性

　　為了將 MWCNTs 引入到 nsPEF 殺傷細胞的研究中，必須保證其對細胞具有低毒性，即高的生物相容性。A375 細胞生長于含有不同濃度 MWCNTs 的環境中，通過測量 MWCNTs 對細胞活性的影響確定合理的 MWCNTs 濃度。圖 4 顯示，當 MWCNTs 濃度為 300 μg/ml 時，細胞活性降低到 92%，并且隨著 MWCNTs 濃度的升高，細胞活性越低，與對照 組 相 比 ， 組 間 及 組 內 數 據 都 具 有 統 計 學 差 異(P<0.05)。相反，當 MWCNTs 濃度小于或等于 200 μg/ml 時，細胞活性幾乎沒有變化，表明在此濃度范圍內，MWCNTs 對細胞活性無影響，與對照組相比，組間及組內數據都不具有統計學差異(P>0.05)。即后續 nsPEF 處理 A375 細胞所用 MWCNTs 濃度小于或等于 200 μg/ml 即可。

　　2.2 細胞活性隨不同脈沖參數的變化規律

　　設定 nsPEF 處理 A375 細胞時的 MWCNTs 濃度為無毒性時的最大值，即 200 μg/ml，在此基礎上通過改變場強、脈寬、脈沖個數，研究 MWCNTs 聯合 nsPEF 處理腫瘤細胞的劑量效應，并建立細胞活性與單因素間的擬合公式。圖 5 顯示了場強、脈寬、脈沖個數等單因素對細胞活性的影響結果。實驗結果以柱狀圖和折線圖疊加在一起的方式展示，紅色折線(實線)和藍色折線(虛線)分別表示不加 MWCNTs 以及加 MWCNTs 的實驗結果變化趨勢。圖例中“–MWCNTs”和“+MWCNTs”分別指“不加 MWCNTs”以及“加 MWCNTs”。與不加 MWCNTs 的結果相比，加入 MWCNTs 可以明顯降低細胞活性，但并沒有影響細胞活性隨單因素變化的下降規律。圖 5(a)表明，當固定脈寬 300 ns、脈沖個數 100 個時，細胞活性隨場強呈現 S 型衰減;圖 5(b)表明，當固定場強 6 kV/cm、脈沖個數 100 個時，細胞活性隨脈寬呈現 S 型衰減;圖 5(c)表明，當固定場強 6 kV/cm、脈寬 300 ns 時，細胞活性隨脈沖個數呈現指數型衰減。

　　為了更清晰地表明并且預測細胞活性隨各個脈沖參數的變化趨勢，采用 logistic 回歸模型擬合實驗數據以得到細胞活性的輸入輸出公式。 Logistic 回歸模型幾乎已經成為流行病學和醫學中最常用的分析方法之一，尤其適合根據危險因素預測某疾病發生的概率。Cole 在研究微生物熱失活時針對細菌存活率隨熱處理時間呈 S 型曲線下降的趨勢提出了對應的 logistic 模型[14]，此模型也適用于指數衰減型曲線的擬合，相關公式為：  0 10 1 exp(4 ( log ( ))/( )) 10 t t S t             (1)其中，t 為自變量，S´為觀察到的生物學效應，參數 α 和分別代表曲線上漸近線(t=0)和下漸近線(t→∞)對應的細菌存活率的對數，δ 和 t0 分別表示曲線的最大斜率以及最大斜率所對應的橫坐標位置。根據圖 5 所示結果，細胞活性在脈沖參數為低劑量時幾乎沒有變化，接近于 100，即曲線上漸近線為 100，所以 α 的值可以由下式計算得出： 10    log (100) 2 (2)修正后的 logistic 模型公式為：  0 10 2 2 1 exp(4 ( log ( ))/( 2)) 10 t t S t           (3)公式(3)中的參數含義與公式(1)一致。利用 Matlab 對實驗數據進行一元非線性擬合可以得到公式(3)中三個未知參數的最優值以及擬合準確度 R 2，從而可以確定曲線的函數關系式，對應的擬合曲線和 R 2 見圖 6。紅色曲線(實線)和藍色曲線(虛線)分別代表用 logistic 模型對不加 MWCNTs 以及加 MWCNTs 的實驗結果擬合得到的曲線。R 2 被用來評價模型的擬合準確度，其介于 0 到 1 之間，越接近于 1，說明所選模型與實驗結果的匹配度越高。

　　由各曲線的 R 2 可知，采用 logistic 模型可以較為準確地描述實驗規律。圖 6 表明，細胞活性隨場強、脈寬變化時具有閾值效應，即在低脈沖劑量下，細胞活性幾乎不變，當脈沖劑量高于某個閾值后，細胞活性開始急劇下降，并且在下降到一定程度后開始飽和。相比之下，細胞活性隨脈沖個數的增加沒有明顯的閾值變化點，但是也會隨著脈沖個數的增加出現飽和趨勢。

　　2.3 細胞活性與多因素間的歸一化關系

　　為了進一步分析有無 MWCNTs 時場強、脈寬、脈沖個數三個參數與細胞活性的綜合關系，假設細胞活性 S´與注入的脈沖能量密度 σE2 τN 有關，σ 為細胞懸液的電導率，當 σ 為一定值時：    0.5 S F E N  (4)式中，F 為 E(τN) 0.5 的函數。以脈沖注入能量 E(τN) 0.5 為橫坐標，細胞活性為縱坐標，繪出如圖 7 所示的散點圖，脈沖注入能量為 0 時即為對照組。圖 7 中紅色曲線(實線)與藍色曲線(虛線)代表的含義與圖 6 類似。圖 7 表明，不論有無 MWCNTs，細胞活性與脈沖注入能量 E(τN) 0.5之間整體呈現 S 型的變化規律。即當脈沖注入能量很小且未達到所需的能量閾值時，基本不影響細胞活性;當脈沖注入能量超過閾值點時，細胞活性開始出現急劇下降，最后穩定在某一飽和值，此時細胞活性隨脈沖注入能量的增大幾乎沒有變化。

　　基于 logistic 模型，得到細胞活性 S´與脈沖注入能量 E(τN) 0.5 的擬合曲線，如圖 7 所示。表 2 為對應擬合曲線的參數最優值及擬合度。 由 logistic 模型中參數 ω 的物理含義可得，細胞活性在不加 MWCNTs 和加 MWCNTs 時所達到的飽和值分別為 10 0.559 9=3.63 和 10 0.538 6=3.46，兩者之間并無明顯區別，均近似為 3.5。細胞活性閾值約為 90(曲線下降階段距離上漸近線 10%的位置)，飽和值約為 12(曲線下降階段距離下漸近線 10%的位置)[15]。細胞活性在不加 MWCNTs 以及加 MWCNTs 的情況下達到閾值所需要的注入劑量分別為 654 和 540，達到飽和值所需要的注入劑量分別為 1 190 和 912。即 MWCNTs 的引入可以同時減小殺傷細胞所需的起始能量閾值和飽和能量值。

　　3 討論

　　3.1 不同濃度 MWCNTs 對細胞活性的影響

　　不同濃度MWCNTs的毒性實驗表明，MWCNTs 誘導的細胞毒性具有劑量依賴性，即MWCNTs濃度越高，毒性越強。需要注意的是，除了MWCNTs，在碳納米管的制備過程中，還殘留有少量的催化劑和非離子表面活性劑[9,16]。其中，非離子表面活性劑主要用于解決碳納米管的團聚問題。研究表明， MWCNTs的毒性主要由殘留催化劑以及分散劑造成，并且殘留物的濃度越高，對細胞活性的影響越明顯[17,18]，這與本實驗的結果相符。

　　3.2 細胞活性隨不同脈沖參數的變化規律

　　細胞在正常的生理機能狀況下，由于其膜的選擇通透性會阻止大分子物質的通過，從而維持細胞內外環境的平衡。但是當細胞暴露于電場中，電荷會向細胞膜兩側積累，形成跨膜電位。當跨膜電位超過細胞膜的絕緣強度時，細胞膜上會產生微孔 [19]，打破細胞內外環境的平衡，從而影響細胞的正常生長狀態。對于單個球形細胞，不可逆電穿孔所需要的外加場強閾值Et可以表示為[20]：

　　E d (5)其中，Δφ 為細胞膜閾值跨膜電位，d 是球形細胞的直徑，θ 是細胞膜上特定位置的法線方向與外加電場 E 方向的夾角。除了外加電壓要達到閾值，電穿孔現象是否可以發生還取決于脈沖持續時間[21]。如果施加的脈沖電壓持續時間太短，在脈沖電場撤去后細胞膜兩側的電荷分布會重新恢復到初始狀態，無法產生電穿孔效應。球形細胞達到閾值跨膜電位所需要的最短脈沖持續時間 τ´(時間常數)為[22]： 2 1 ( ) 2 Cd     (6) ρ1 和 ρ2 分別為細胞外液和細胞質的電阻率，C 為細胞膜的等效電容。綜上所述，根據電穿孔原理可知，電穿孔效應的產生不僅要求外加電壓超過一定閾值，還要求脈寬達到細胞膜的充電時間常數。這也解釋了圖 6 中為 什 么 當 場 強 或 者 脈 寬 過 低 時 ， 不 論 有 無 MWCNTs，nsPEF 幾乎對細胞活性無影響，從而細胞活性隨場強和脈寬的增加均呈現 S 型變化。細胞活性隨脈沖個數的變化幾乎沒有閾值效應，而是呈現指數型變化，主要是因為當改變脈沖個數時，場強和脈寬的固定值達到了電穿孔所需要的閾值。脈沖個數越多，脈沖電場造成的細胞穿孔狀態維持時間越久，細胞內外的物質交換越充分，也越容易破壞細胞的生存環境，從而造成細胞死亡。

　　3.3 MWCNTs 增強 nsPEF 殺傷細胞效果的機制

　　CNTs是一種具有特殊結構(徑向尺寸為納米級，軸向尺寸為微米級，管子兩端基本上都封口)的一維量子材料，主要由呈六邊形排列的碳原子構成數層到數十層的同軸圓管。CNTs具有獨特的電學特性，呈現良好的金屬性(電導率約為104 S·cm-1)，研究表明，其載流能力是銅線的1 000倍[23]，使其可以在癌細胞附近形成三維導電基質。將具有一維結構的單根CNTs插入到幅值為E0的均勻電場區域中，會在CNTs的尖端產生場強增強效果。CNTs尖端的電場增強效果可以通過以下公式估算[24]： tip 0 E L E D  (7) Etip 為 CNTs 尖端的電場強度，β 是一個常數， L 和 D 分別表示 CNTs 的長度和外徑，CNTs 的高縱橫比(L/D)解釋了為什么其可以很好地集聚場強，從而促進電穿孔的效果。除此之外，研究表明處于電磁場中的 CNTs 還可以通過與細胞膜直接物理接觸對其產生機械破壞作用[11,25]。CNTs 在未施加電場之前將會因為其大比表面積和強烈的表面靜電作用隨機吸附到細胞膜周圍，并且部分 CNTs 還會與細胞膜磷脂結合，此時 CNTs 的存在對細胞形態無影響。但當施加電場后， CNTs 會因為在電磁場中受到極化作用而旋轉，直至與外加電場方向相同，在 CNTs 的旋轉過程中，其尖端受到的介電泳力將因為機械作用引起細胞膜變形和穿孔。總之，CNTs 的局部電場增強能力和物理破壞能力可以有效提高 nsPEF 殺傷癌細胞的效果。

　　4 結論

　　本文，我們在確定 MWCNTs 安全濃度的基礎上探究了 MWCNTs 聯合 nsPEF 影響離體 A375 細胞活性的劑量效應。細胞活性隨各個脈沖參數的變化整體呈現劑量越大，活性越低的規律。細胞活性隨場強、脈寬的變化具有閾值效應，但是隨脈沖個數的變化卻沒有明顯的閾值效應，并且隨各個脈沖參數的變化都呈現飽和效應。細胞活性與脈沖能量密度的歸一化關系呈 S 型規律。具有良好電學特性和一維結構的 MWCNTs 不影響上述變化規律，但是可以顯著增強 nsPEF 對腫瘤細胞的殺傷效果，對提高臨床治療過程中的電氣安全性具有重要意義。

　　參考文獻

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