目的：探討多沙唑嗪對兔腹主動脈球囊損傷后血管狹窄的影響，及其與血清一氧化氮、血管內(nèi)膜中膜平滑肌細(xì)胞增生的關(guān)系。
　　方法：23只新西蘭兔隨機(jī)分為3組，其中正常對照組5只，球囊損傷組9只，多沙唑嗪組9只。正常對照組用普通飼料喂養(yǎng)，不予任何方式處理。另兩組行腹主動脈球囊損傷術(shù)，同時(shí)多沙唑嗪組應(yīng)用多沙唑嗪控釋片4mg/d，術(shù)后4周處死兔，觀察各組血清一氧化氮差異，以及血管損傷處血管內(nèi)膜、中膜、外膜厚度、新生內(nèi)膜面積、管腔面積、內(nèi)彈力層及外彈力層包圍面積、血管內(nèi)膜中膜增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）免疫組化陽性平均灰度的變化情況。
　　結(jié)果：球囊損傷成功造成兔血管狹窄模型。手術(shù)開始時(shí)多沙唑嗪組和球囊損傷組兩組血清一氧化氮水平無差異(p＞0.05)，手術(shù)4周后多沙唑嗪組血清一氧化氮含量較球囊損傷組增高（p<0.001）。多沙唑嗪組與球囊損傷組血管損傷處相比血管內(nèi)膜、外膜增生減輕（p<0.05），新生內(nèi)膜面積減少（p<0.001），管腔面積增加（p<0.001），內(nèi)彈力層和外彈力層包圍面積增加（p<0.001），血管內(nèi)膜中膜PCNA陽性平均灰度降低（p<0.001）。
　　結(jié)論：多沙唑嗪可以抑制球囊損傷后兔腹主動脈血管的狹窄，可以抑制血管內(nèi)膜中膜平滑肌細(xì)胞增殖，可以增加血清一氧化氮含量。這可能有助于減輕或預(yù)防PCI術(shù)后再狹窄，為臨床藥物預(yù)防PCI術(shù)后再狹窄開辟一種新的治療途徑。
　　關(guān)鍵詞：狹窄，多沙唑嗪控釋片，一氧化氮，血管平滑肌細(xì)胞
　　
　　前言
　　PTCA術(shù)后6個(gè)月高達(dá)30－40％的再狹窄率【1】成為其廣泛應(yīng)用和發(fā)展的主要障礙。研究表明血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是再狹窄的啟動因素，血管平滑肌細(xì)胞增殖是決定再狹窄的關(guān)鍵因素，血管重構(gòu)參與再狹窄的形成【2】。多沙唑嗪是美國Pfizer公司從1978年最早研究開發(fā)的一種長效選擇性α1交感神經(jīng)腎上腺素能受體阻滯劑,被廣泛用于治療高血壓和前列腺肥大并取得了良好的效果。研究表明多沙唑嗪可以抑制前列腺平滑肌細(xì)胞的增殖和促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的凋亡，并且抑制細(xì)胞外基質(zhì)的合成【3】。這一作用是否能出現(xiàn)在心血管系統(tǒng)尚不明確，曾有研究提示多沙唑嗪可能具有降低PTCA后血管再狹窄的作用【4】。本研究試圖探討多沙唑嗪對血管再狹窄的影響及機(jī)制。觀察其能否減輕血管損傷后狹窄的程度，并試圖探索其機(jī)制，為以后臨床防治再狹窄提供理論依據(jù)。
　　材料和方法
　　1材料
　　健康純種新西蘭兔23只，體重2.0-2.5kg，由昆明醫(yī)學(xué)院動物科提供。隨機(jī)分為3組，正常對照組5只，球囊損傷組9只，多沙唑嗪組9只。三組性別、體重?zé)o差異。
　　2方法
　　2.1動物血管球囊損傷后狹窄模型的建立
　　用氯氨酮注射液（25mg/kg）和氯丙嗪注射液（12.5mg/kg）肌肉注射麻醉兔，固定于手術(shù)臺上。取右股動脈區(qū)為手術(shù)區(qū)，75％酒精消毒，沿股動脈方向作一縱切口，逆行鈍性分離并游離股動脈。在股動脈上剪一切口，放置5F動脈鞘，經(jīng)動脈鞘將3.5×23mm球囊送入20cm至腹主動脈膈下處，用壓力泵以8個(gè)大氣壓充盈球囊，回抽球囊，直至有阻力為止，表明球囊已到腹主動脈與髂動脈分叉處，釋放球囊內(nèi)壓力，1分鐘后，重復(fù)送入球囊至20cm標(biāo)記處，再次擴(kuò)張，如此反復(fù)抽拉3次，每次30秒，間隔1分鐘，術(shù)后即刻通過耳緣靜脈注射肝素鈉5000u并注射慶大霉素8萬u預(yù)防感染。局部縫合包扎。術(shù)后繼續(xù)1％膽固醇高脂飼料喂養(yǎng)4周，多沙唑嗪組給予多沙唑嗪控釋片4mg/d灌胃，4周后經(jīng)耳緣靜脈注入50ml空氣處死兔。迅速取出腹主動脈，放入4%多聚甲醛中固定，待做病理切片及PCNA分析用。
　　2.2組織形態(tài)學(xué)觀察及計(jì)算機(jī)圖像分析
　　取球囊損傷部位的腹主動脈,每段長4-6mm,置于4%多聚甲醛溶液中固定24小時(shí),不同濃度酒精逐級脫水,石蠟包埋,連續(xù)切片5張(片厚5μm),行H-E染色,中性樹膠封片,在光學(xué)顯微鏡下觀察血管壁厚度、管腔大小及內(nèi)膜增生情況。利用Hias-1000計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分別測出血管內(nèi)膜、中膜、外膜厚度、新生內(nèi)膜面積、管腔面積、內(nèi)彈力層和外彈力層包圍面積。
　　2.3免疫組化標(biāo)記增殖細(xì)胞
　　組織切片于6ml/l過氧化氫液中孵育30分鐘，PBS液洗浴，室溫下與單克隆抗體孵育60min。使用兔PC-10單抗標(biāo)記增殖細(xì)胞核抗原(proliferationcellnucleiantigen,PCNA),PBS液洗浴后，室溫下與生物素標(biāo)記的二抗孵育60分鐘，DAB染色，蘇木精復(fù)染。各組免疫組化切片應(yīng)用Hias-1000圖像分析系統(tǒng)對血管內(nèi)膜中膜陽性反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行半定量檢測分析。PCNA陽性表達(dá)為細(xì)胞核呈棕黃色。每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野，在400倍放大下，測量血管內(nèi)膜中膜免疫組化染色灰度值，然后取其平均值。灰度值從0到255共分為256個(gè)等級，灰度值越大表示免疫組化染色越深，平滑肌細(xì)胞增殖越明顯。
　　2.4血清一氧化氮檢查
　　正常對照組于實(shí)驗(yàn)開始時(shí)經(jīng)耳緣靜脈抽血5ml，測定血清一氧化氮（NO）作為正常對照，另外兩組分別于高脂飼料喂養(yǎng)5天時(shí)和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)經(jīng)耳緣靜脈抽血5ml測定NO。血清NO測定采用硝酸還原酶法，應(yīng)用一氧化氮試劑測定盒。
　　2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　使用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包。計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組內(nèi)比較使用配對t檢驗(yàn)，組間比較使用單因素方差分析。以P<0.05為結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果
　　1.三組血管形態(tài)學(xué)變化
　　正常對照組血管內(nèi)皮細(xì)胞正常、內(nèi)彈力板完整，內(nèi)膜面積為零。球囊損傷組血管內(nèi)膜有程度不等的增厚，主要由平滑肌細(xì)胞、散在的炎性細(xì)胞組成，細(xì)胞外基質(zhì)有大量不定形物質(zhì)沉積，內(nèi)彈力板分離斷裂，中膜平滑肌增生，管腔明顯狹窄。多沙唑嗪組血管內(nèi)膜稍有增厚，較球囊損傷組明顯減輕，平滑肌細(xì)胞增生不明顯，管腔狹窄不明顯。
　　表1.三組血管內(nèi)膜、中膜、外膜厚度（單位：um）
　　組別 外膜厚度 中膜厚度 內(nèi)膜厚度
　　正常對照組 210±32 233±24 10±7
　　球囊損傷組 587±33 223±36 920±57
　　多沙唑嗪組 368±58 228±25 30±6
　　如表1所示，球囊損傷組、多沙唑嗪組損傷部位血管內(nèi)膜、外膜均較正常對照組增厚(P<0.001)，但是多沙唑嗪組其損傷部位血管內(nèi)膜、外膜厚度均較球囊損傷組減低（P<0.01）。而中膜三組無顯著性差異（p>0.05）。
　　表2.三組血管動脈管腔面積、新生內(nèi)膜面積比較（單位：um2）
　　組別 管腔面積 新生內(nèi)膜面積
　　正常對照組 3720±40 0
　　球囊損傷組 1370±28 1213±260
　　多沙唑嗪組 3430±15 82±12
　　本研究還觀察到多沙唑嗪組、球囊損傷組血管管腔面積減小（與正常對照組相比，p<0.05），新生內(nèi)膜面積明顯增加（與正常對照組相比，p<0.001），但是多沙唑嗪組血管管腔面積較球囊損傷組明顯增大（p<0.001），新生內(nèi)膜面積明顯減小（p<0.001）。（見表2）。
　　表3.三組血管動脈內(nèi)彈力層和外彈力層包圍面積（單位：um2）
　　組別 內(nèi)彈力層包圍面積（um2） 外彈力層包圍面積（um2）
　　正常對照組 3800±412 4900±159
　　球囊損傷組 2595±232 3866±245
　　多沙唑嗪組 3466±143 4548±231
　　此外雖然多沙唑嗪組和球囊損傷組內(nèi)彈力層包圍面積和外彈力層包圍面積減小（與正常對照組相比，p<0.01），但是多沙唑嗪組內(nèi)彈力層包圍面積和外彈
　　力層包圍面積均較球囊損傷組有顯著性增加（p<0.05）。（見表3）。
　　2三組血清NO結(jié)果
　　正常對照組血清NO含量為93.72±7.71umol/l，與試劑盒所提供的兔血清NO含量相符。球囊損傷組術(shù)前血清NO含量為94.58±18.0umol/l，多沙唑嗪組術(shù)前血清NO為89.94±18.01umol/l，三組間無顯著性差異（p>0.05）。球囊損傷組術(shù)后4周時(shí)血清NO含量為21.63±13.56umol/l，與球囊損傷組術(shù)前比較明顯降低（p<0.001）。多沙唑嗪組術(shù)后4周時(shí)血清NO含量為62.57±17.33umol/l，與多沙唑嗪組術(shù)前相比明顯降低（p<0.001）。但是多沙唑嗪組術(shù)后4周時(shí)血清NO明顯比球囊損傷組術(shù)后4周時(shí)增加（p<0.05）。
　　3三組PCNA免疫組化陽性結(jié)果
　　正常對照組血管內(nèi)膜中膜PCNA陽性平均灰度為3.4±0.9。球囊損傷組血管內(nèi)膜中膜可見大量平滑肌細(xì)胞增生，PCNA陽性平均灰度為112.8±23.4（與正常對照組比較，p<0.001）。多沙唑嗪組血管內(nèi)膜中膜PCNA陽性平均灰度9.5±1.3（與正常對照組比較，p<0.05）。多沙唑嗪組血管內(nèi)膜中膜PCNA陽性平均灰度與球囊損傷組相比明顯低（p<0.001）。
　　討論
　　PTCA術(shù)后再狹窄是動脈損傷后血管過度修復(fù)反應(yīng)的表現(xiàn)，不僅涉及血管內(nèi)膜和中膜，血管外膜在損傷修復(fù)過程中也有作用，可能參與再狹窄的形成。再狹窄的血管重塑機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過程，大致由血管彈性回縮、血栓形成、生物活性因子的釋放、VSMC增殖遷移、新生內(nèi)膜形成、內(nèi)皮修復(fù)、細(xì)胞外基質(zhì)的形成及血管重塑等環(huán)節(jié)構(gòu)成。血管重塑是血管壁為適應(yīng)血管腔內(nèi)血流動力學(xué)環(huán)境變化而產(chǎn)生的病理生理現(xiàn)象，包括適應(yīng)性血管重塑和病理性血管重塑，其機(jī)制尚不明確。
　　本研究采取球囊血管內(nèi)膜剝脫法復(fù)制血管再狹窄模型，此種方法造成血管的內(nèi)膜增生與人類PTCA術(shù)后再狹窄的病理過程相似【5】。雖然不能模仿人體冠脈狹窄PTCA術(shù)后再狹窄的全部病理生理過程，但著眼于其中最重要的血管平滑肌細(xì)胞增殖和血管重塑環(huán)節(jié)并給予處理，希望從中得到啟示。本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用多沙唑嗪控釋片4mg/d治療4周能明顯抑制兔損傷處動脈內(nèi)膜、外膜的增生，并明顯增加血管管腔面積，增加血管內(nèi)彈力層包圍面積和外彈力層包圍面積。這表明多沙唑嗪控釋片能減輕球囊損傷后的血管狹窄，并對血管重塑產(chǎn)生正性調(diào)節(jié)作用。與Vashisht等【6】對兔的腹主動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)后應(yīng)用多沙唑嗪治療后發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜增生明顯被抑制，而且呈劑量依賴性的研究相一致。
　　VSMC的增殖和遷移是血管內(nèi)膜增生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而抑制VSMC的增殖和遷移，則是阻止血管狹窄性疾病的一個(gè)重要方面。PCNA位于細(xì)胞核內(nèi)，且僅在S期出現(xiàn)，S期結(jié)束時(shí)又消失，所以又稱細(xì)胞周期蛋白，是S期的特異性標(biāo)記，被作為SMC增殖的指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，多沙唑嗪組損傷動脈內(nèi)膜中膜PCNA染色陽性顆粒明顯少于球囊損傷組，說明多沙唑嗪明顯抑制了損傷動脈處的VSMC增殖。
　　研究表明多沙唑嗪可以通過抑制ａ1腎上腺素能受體而抑制VSMC增殖。此外多沙唑嗪能通過與ａ1受體拮抗無關(guān)的機(jī)制抑制VSMC多條有絲分裂信號途徑。Ulrich等已經(jīng)證明，多沙唑嗪可以通過增加細(xì)胞周期依賴性激酶抑劑P27的表達(dá)，抑制Rb的磷酸化，使VSMC的有絲分裂停止在G1期，從而抑制細(xì)胞的增殖。KintscherU等【7】也發(fā)現(xiàn)多沙唑嗪可抑制人冠脈VSMC從G1期至S期的轉(zhuǎn)換，這種作用與多沙唑嗪阻止Rb的磷酸化有關(guān)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)多沙唑嗪能抑制血清引起的P27蛋白降解，使VSMC中P27蛋白始終處于較高水平，即阻止P27下調(diào)而增加P27的表達(dá)。P27屬于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑家族，主要通過抑制G1-S限制點(diǎn)中的各種周期蛋白及周期蛋白依賴性激酶而使細(xì)胞停滯于G0/G1期。
　　NO主要由內(nèi)皮細(xì)胞和VSMC分泌，由左旋-精氨酸經(jīng)一氧化氮合成酶（NOS）的作用而生成。具有舒張血管、抑制VSMC增殖的作用。有關(guān)多沙唑嗪對NO影響的研究尚不多見。國外有研究報(bào)道【8】多沙唑嗪在降壓過程中可以增強(qiáng)腎臟組織切片中的NOS活性，增加NO的產(chǎn)生。國內(nèi)楊君等【9】研究發(fā)現(xiàn)高血壓患者的腸系膜動脈VSMC具有分泌NO的功能，服用多沙唑嗪的患者其腸系膜動脈VSMC分泌的NO明顯增加。本研究發(fā)現(xiàn)球囊損傷血管內(nèi)膜后血清NO濃度明顯降低，應(yīng)用多沙唑嗪4周可使兔血清NO含量明顯上升。結(jié)果與國內(nèi)、外的相關(guān)報(bào)道相符。NO對再狹窄有防治作用，主要通過抑制VSMC增殖、抑制血小板粘附和聚集、抑制白細(xì)胞粘附、影響血管重塑等機(jī)制發(fā)揮作用【10】。有研究發(fā)現(xiàn)NO是通過上調(diào)p27和p21,延長細(xì)胞周期而抑制VSMC增生的【11】。NO通過使p27和p21的表達(dá)上調(diào)，抑制Rb蛋白磷酸化，使VSMC停滯在G0期，細(xì)胞周期在G1期受阻,SMC增殖受抑。本研究亦發(fā)現(xiàn)多沙唑嗪能夠增加血清NO含量，并表現(xiàn)為減輕血管狹窄，這是否為多沙唑嗪通過增加血清NO含量，上調(diào)p27和p21表達(dá)，抑制VSMC增殖，從而達(dá)到減輕血管狹窄的結(jié)果還有待于進(jìn)一步研究。
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